Determinación cuantitativa de indigotina e indirubina en el índigo natural mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Quantitative HPLC determination of indigotin and indirubin in indigo naturalis)

Qian B

Description

g/ml for indigotin and indirubin, respectively. A high degree of specificity and robustness, as well as repeatability (relative standard deviation less than 5% for both standards and the extracts) and accuracy (% recoveries greater than 95%) were also achieved.

Sujets

• Cromatografía líquida de alta eficacia
• Indigo carmine

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• Publié le: 01 janvier 2005
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Extrait

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE INDIGOTINA E INDIRUBINA EN EL ÍNDIGO NATURAL MEDIANTE... 429
QUANTITATIVE HPLC DETERMINATION OF INDIGOTIN AND INDIRUBIN IN INDIGO NATURALIS
Determinación cuantitativa de indigotina
e indirubina en el índigo natural mediante
cromatografía líquida de alto rendimiento
(HPLC)
Quantitative HPLC determination of indigotin and indirubin in indigo
naturalis
1 2 * 2 1 1 1QIAN B , PANICHAYUPAKARANANT P , SIRIKATITHAM A , ZHANG RP , GUO YD Y WU YQ
1 Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Colegio médico de Kunming, Kunming 650031,
República Popular China
22222 Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Príncipe de Songkla, Hat-Yai,
Songkla 90112, Tailandia
*Remitir correspondencia al profesor adjunto P. Panichayupakaranant, Faculty of Pharmaceutical
Sciences, Prince of Songkla University, Hat-Yai, Songkla 90112 Thailand.
correo electrónico: [e-mail]
RESUMEN
Se desarrolló un método de cromatografía líquida de alto rendimiento cuantitativa y de separación
utilizando una columna RP-18 eluida isocráticamente con metanol y agua (73:27, v/v) para analizar los
compuestos activos isoméricos indigotina e indirubina presentes en el extracto de cloroformo del índigo
natural. Se utilizaron soluciones estandarizadas de indigotina e indirubina para evaluar la linealidad, la
precisión (replicabilidad), la exactitud y la especificidad del método. Los resultados mostraron una
22222linealidad (r > 0,999) de entre 1,8 y 16,2 µµµµµg/ml para la indigotina y entre 1,6 y 14,4 µµµµµg/ml para lag/ml para lag/ml para lag/ml para lag/ml para la
indirubina. También se obtuvo un alto grado de especificidad, robustez, replicabilidad (desviación
estándar relativa inferior al 5% para estándares y extractos) y exactitud (% de recuperaciones superior
al 95%).
PALABRAS CLAVE: Baphicacanthus cusia. HPLC. Índigo natural. Indigotina. Indirubina.
ABSTRACT
A high-performance liquid chromatographic separation and quantitative method using a RP-18 column
eluted isocratically with methanol and water (73:27, v/v) was developed to analyze the isomeric active
compounds, indigotin and indirubin, present in the chloroform extract of indigo naturalis. Standardized
solutions of indigotin and indirubin were used to evaluate linearity, precision (repeatability), accuracy
2and specificity of the method were evaluated. The results exhibited a linearity (r > 0.999) of between
1.8 - 16.2 µg/ml and 1.6 - 14.4 µg/ml for indigotin and indirubin, respectively. A high degree of
specificity and robustness, as well as repeatability (relative standard deviation less than 5% for both
standards and the extracts) and accuracy (% recoveries greater than 95%) were also achieved.
KEY WORDS: Baphicacanthus cusia. HPLC. Indigo naturalis. Indigotin. Indirubin.
Ars Pharm 2005; 46 (4): 429-438.QIAN B, PANICHAYUPAKARANT P, SIRIKATITHAM A, ZHANG RP, GUO YD, WU YQ.430
INTRODUCCIÓN INTRODUCTION
El índigo natural es un polvo de color azul Indigo naturalis is a dark blue powder pre-
oscuro que se extrae de las hojas y los tallos pared from the leaves and stems of Baphica-
de las plantas Baphicacanthus cusia (Ness) canthus cusia (Ness) Bremek. (Fam. Acantha-
Bremek (familia de las acantáceas), Polygo- ceae), Polygonum tinctorium Ait (Fam.
num tinctorium Ait (familia de las poligoná- Polygonaceae). Isatis tinctoria Fort. (Fam.
ceas), Isatis tinctoria Fort (familia de las cru- Cruciferae) or Indigofera tinctoria L. (Fam.
cíferas) o Indigofera tinctoria L. (familia de Leguminosae) through manufacturing proces-
las leguminosas) mediante procesos de fabri- ses. It is used in traditional Chinese medicine
cación. Se utiliza en la medicina tradicional to treat respiratory viral infection and other
1china para el tratamiento de infecciones vira- inflammatory diseases . The powder contains
les respiratorias y otras enfermedades infla- a high level of the blue dye, indigotin (indi-
1 2,3 4 5matorias . El polvo contiene un alto nivel de go) , but the antiviral , anti-inflammatory and
2,3 6-9colorante azul, la indigotina (índigo) , pero antileukemic activities are attributed to the
4 5la actividad antiviral , antiinflamatoria y an- red color isomer, indirubin (isoindigotin or
6-9tileucémica se atribuye al isómero de color indigo red (Figure 1). The quality of indigo
rojo, la indirubina (isoindigotina o índigo naturalis often varies due to the different re-
carmín, figura 1). La calidad del índigo natu- sources, cultivation places and manufacturing
ral varía a menudo según los distintos recur- processes. Several analytical methods for quan-
sos, lugares de cultivo y procesos de fabrica- titative analysis of indigo naturalis, including
10ción. Se han empleado varios métodos para el TLC-densitometry , HPTLC followed by den-
11 12análisis cuantitativo del índigo natural, entre sitometric analysis , spectrophotometry and
los que se incluyen la densitometría-cromato- high-performance liquid chromatography
10 13-14grafía de capa fina (TLC) , la cromatografía (HPLC) have been reported. Although the
de capa fina de alto rendimiento (HPTLC) HPLC method for quantitative analysis of in-
11seguida de análisis densitométrico , la espec- digo naturalis has been developed, validation
12trofotometría y la cromatografía líquida de of the analytical procedure is not yet establis-
13-14alto rendimiento (HPLC) . Aunque se ha hed. As part of our interest in the quality control
desarrollado el método HPLC para el análisis of indigo naturalis raw materials, we have
cuantitativo del índigo natural, aún no se ha searched for an easy and robust method for
realizado una validación del procedimiento quantitative analysis. In this study, indigo
analítico. Como parte de nuestro interés por naturalis prepared from B. cusia was used.
el control cualitativo de la materia prima del The aim of this work was to develop and validate
índigo natural, hemos buscado un método fácil an analytical method for the quantification of
y robusto para el análisis cuantitativo. En este indigotin and indirubin through HPLC.
estudio se utilizó índigo natural extraído de la
planta B. cusia. El objetivo de este trabajo fue
desarrollar y validar un método analítico para
la cuantificación de la indigotina y la indiru-
bina mediante cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC).
FIGURA 1. Estructuras químicas de la indigotina y la indirubina.
FIGURE 1. Chemical structures of indigotin and indirubin.
Ars Pharm 2005; 46 (4): 429-438.DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE INDIGOTINA E INDIRUBINA EN EL ÍNDIGO NATURAL MEDIANTE... 431
QUANTITATIVE HPLC DETERMINATION OF INDIGOTIN AND INDIRUBIN IN INDIGO NATURALIS
MATERIALES Y MÉTODOS MATERIAL AND METHODS
1. Material de la planta 1. Plant material
El índigo natural se adquirió de la compa- Indigo naturalis was purchased from the
ñía de materiales médicos de Yunnan, Repú- Material Medic Company of Yunnan, P.R.China.
blica Popular China.
2. Chemicals and reagents
2. Productos químicos y reactivos
Indigotin and Indirubin were received from
La indigotina y la indirubina se recibieron Chinese Pharmaceutical and Biological Tes-
de institutos de pruebas biológicas y farma- ted Institutes. Methanol (HPLC grade), chlo-
céuticas de China. De Labscan Asia (Tailan- roform, methanol and ethyl acetate (analytical
dia) se adquirió metanol (grado HPLC), clo- grade) were purchased from Labscan Asia
roformo, y acetato de etilo y metanol (grado (Thailand). Acetic acid was from J.T. Baker
analítico). El ácido acético se obtuvo de J.T. (USA). Water was purified in a Milli-Q sys-
Baker (EE.UU.). El agua se purificó en un tem (Millipore, Bedford, MA, USA).
sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA,
EE.UU.).
3. Standard solution
3. Solución estándar Separate stock solutions of the reference
standards, indigotin and indirubin were made
Se prepararon soluciones madre indepen- in chloroform. Working solution of the com-
dientes en cloroformo de los estándares de bined standards was subsequently prepared in
referencia, indigotina e indirubina. Posterior- chloroform and diluted to provide a series of
mente, se preparó una solución de trabajo en indigotin and indirubin concentrations ranging
cloroformo de los estándares combinados. Esta from 1.8 - 16.2 µg/ml and 1.6 - 14.4 µg/ml,
solución se diluyó para obtener una serie de respectively, for use in constructing calibra-
concentraciones de indigotina e indirubina tion curves for each of the target analytes.
comprendida entre 1,8 y 16,2 µg/ml y 1,6 y
14,4 µg/ml, respectivamente, que se utilizó para
construir las curvas de calibración de cada 4. Sample extraction
uno de los analitos determinados.
4.1 Suitable solvent for extraction
4. Extracción de muestras A preliminary study was performed in or-
der to obtain a suitable solvent for sample
4.1 Disolvente adecuado para la extracción extraction. Indigo naturalis