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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES  Sciences de la Vie et de la Terre   MEMOIRE présenté par  Magali BELNARD   Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes     ETUDE DE L'EVOLUTION DU POLYMORPHISME GENETIQUE ET DE LA REPONSE HUMORALE DU VIRUS DE L’HEPATITE C (VHC) CHEZ DES PATIENTS COINFECTES PAR LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH) ET ASYMPTOMATIQUES A LONG TERME (ALT)     Soutenue le 21 octobre 2003 devant le jury suivant :  Monsieur le Pr Dominique DORMONés dent  T- Pr i Monsieur le Pr Stéphane RICHARD- Rapporteur  Monsieur le Pr Gilles DUVERLIE- Examinateur                                                Monsieur le Pr. Jean-Marie HURAUX Examinateur - Madame le Dr Annie CAHOUR- Examinateur     Génétique Oncologique EPHE Directeur EPHE: Pr S. RICHARD Faculté de Médecine Paris-Sud E-mail : stephane.richard@kb.u-psud.fr 94276 Le Kremlin Bicêtre  Laboratoire de Genetique Virale du CERVI Directeur de stage : Dr A. CAHOUR Hôpital de la Pitié-Salpêtrière E-mail : cahour@ext.jussieu.fr 105, Bd de l’Hôpital 75013 Paris  ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE  
ETUDE DE L'EVOLUTION DU POLYMORPHISME GENETIQUE ET DE LA REPONSE HUMORALE DU VIRUS DE L’HEPATITE C (VHC) CHEZ DES PATIENTS COINFECTES PAR LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE (VIH) ET ASYMPTOMATIQUES À LONG TERME (ALT)   
Magali BELNARD   Le 21 octobre 2003  RESUME  Il est actuellement que la coinfection par le VHC est fréquente (30%) chez les patients positifs pour le VIH (revuebien établi Maier, 2002). Actuellement, l’infection par le VIH peut être contrôlée grâce à l'introduction de traitements antirétroviraux hautement actifs (HAART), mais ces patients qui survivent plus longtemps à l'infection VIH, décèdent souvent d'une complication hépatique liée à l'infection VHC. Dans ce contexte, la gravité des lésions du foie, survenant 2 à 3 fois plus vite, est plus importante que dans le cadre d’une infection simple par le VHC. C’est pourquoi de nombreuses études visant à étudier les interactions entre ces deux virus ont été menées afin de comprendre les mécanismes impliqués dans ce processus. Cependant, ces observations ont été faites dans le contexte de traitements antiviraux ou d’une immunité altérée. Afin d’étudier l’impact du VIH sur l’évolution du VHC, nous nous sommes intéressés à des patients coinfectés, issus d’une cohorte d’individus ALT pour le VIH présentant l’avantage de posséder une immunité stable (lymphocytes CD4+ > 600/mm3), de n’être soumis à aucun traitement antiviral et de posséder des charges virales VIH fortes (patients progresseurs lents-P) ou faibles (patients non progresseurs-NP). Nous avons étudié, dans un premier temps, l’évolution de la réponse humorale contre plusieurs protéines du VHC afin (i) de compléter les études antérieures caractérisant la réponse cellulaire dirigée contre le VHC et le VIH, chez les NP et (ii) de déterminer la dynamique de cette réponse sous diverses pressions VIH. Dans un second temps, nous avons étudié l’évolution de la variabilité génétique du Site Interne d’Entrée des Ribosomes (IRES), situé dans la région 5’non codante (5’NC) du VHC, dans le plasma et les Cellules Mononucléées du Sang Périphérique (PBMCs) de ces 2 groupes de patients, en vue d’y observer (i) une compartimentation du VHC, (ii) une influence potentielle du VIH sur cette variabilité, (iii) une modification de l’activité traductionnelle des IRES mutés, en lysats de réticulocytes de lapin et sur cellules hépatocytaires. Pour cela, nous avons utilisé d’une part, un test sérologique Inno-Lia IV (Innogenetics) de type immunoblot, nous permettant d’étudier l’intensité de la réponse anticorps (Ac) vis-à-vis de chaque antigène du VHC et d’autre part, nous avons mis au point une stratégie d’étude du polymorphisme conformationnel simple brin (SSCP), associée au clonage et au séquençage, nous permettant d’apprécier la variabilité du VHC dans l’IRES. L’activité traductionnelle des variants sélectionnés et clonés dans un vecteur bicistronique, contenant les gènes de la luciférase, a été mesurée en luminométrie. Les résultats montrent des réponses Ac stables et largement ciblées, traduisant l’infection VHC chronique, mais néanmoins plus faibles vis-à-vis de certaines protéines non structurales (NS4A et NS5A) chez les coinfectés, en comparaison à un groupe de sujets infectés uniquement par le VHC. Il semble également y avoir un profil spécifique des NP avec une réponse plus forte contre E2 chez ces patients. L’étude de la variabilité suggère une tendance évolutive plus probable du VHC sous de fortes charges virales VIH ainsi qu’une réplication adaptative du VHC dans les PBMCs. D’une manière générale, le maintien de la structure et l’absence de modification de la fonctionnalité des IRES sélectionnés (malgré la présence de variants adaptatifs) suggère l’importance de cette structure vis-à-vis du mécanisme de persistance du VHC dans l’organisme.  MOTS CLES : coinfection VIH/VHC, ALT, SSCP, vecteur bicistronique, luminométrie  
 ABREVIATIONS
  3’NC :(région) 3’ non codante 5’NC :(région) 5’ non codante Aa :acide(s) aminé(s) Ac :anticorps ADNc :acide désoxyribonucléique complémentaire Ag :antigène(s)
ALAT :alanine aminotransferase ARNm :acide ribonucléique messager CMH :complexe majeur d’histocompatibilité CPA :cellule(s) présentatrice(s) d’ag(s) CTL :cytotoxic T lymphocyte(s) (lymphocyte(s) T cytotoxique(s)) Dntp(s) :dinucléotide(s) triphosphate(s) eIF :facteur d’initiation eucaryote ELISA :elispot assay (technique elispot) HAART :highly active antiretroviral therapy (traitement antirétroviral hautement actif) HepG2 :cellules d’hépatocarcinome humain HLA :human leucocyte antigen (antigène leucocytaire humain) HNANB :hépatite(s) non A non B HVR :région hypervariable IFN :interféron Il :interleukine IRES :internal ribosomal entry site (site interne d’entrée des ribosomes) ISDR :Interferon sensitivity determining region (région impliquée dans la sensibilité à l’IFN) Kb :kilobase kDA :kiloDalton LB :lymphocyte B MMLV - RT :moloney murin leukemia virus reverse transcriptase nt :nucléotide(s) NK :natural killer pb :paire(s) de bases PBMC(s) :peripheric blood mononuclear cells (cellules mononucléées du sang périphérique) PCR :polymerase chain reaction PePHD :PKR-eIF2a phosphorylation homology domain RE :reticulum endoplasmique  SSCP :single-stranded conformational polymorphism VHA :virus de l’hépatite A VHB :virus de l’hépatite B VHC :virus de l’hépatite C VIH :virus de l’immunodéficience humaine         A - GENERALITES SUR LE VIRUS DE L’HEPATITE C............. 5 1. Historique ............................................................................................................... 5 1.1. La découverte du virus................................................................................. 5 1.2. Classification.................................................................................................... 5 2. Structure du VHC............................................................................................ 6 2.1. La virale..........................................................................................
6 2.2. Le génome.......................................................................................................... 6 2.2.1.1. La région 5'NC`.......................................................................................... 6 2.2.1.2. La région 3'NC............................................................................................ 7 2.2.2.1. La protéine de la capside (protéine C)......................................................... 7 2.2.2.2. Les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2.................................................... 7 2.2.2.3. La protéine P7............................................................................................. 8 2.2.2.4. La protéine F............................................................................................... 8 2.2.3.1. La protéine NS2.......................................................................................... 8 2.2.3.2. La protéine NS3.......................................................................................... 9 2.2.3.3. La protéine NS4A....................................................................................... 9 2.2.3.4. La protéine NS4B....................................................................................... 9 2.2.3.5. La protéine NS5A....................................................................................... 9 2.2.3.6. La protéine NS5B..................................................................................... 10 3. Cycle de réplication........................................................................................ 10 4. Polymorphisme viral...................................................................................... 11 4.1. Les génotypes................................................................................................. 11 4. . Les quasi-espèces........................................................................................... 2 12 B - EPIDEMIOLOGIE - PATHOGENIE................................................... 13 1. Prévalence ............................................................................................................ 13 2. Modes de transmission................................................................................. 13 3. Physiopathologie.............................................................................................. 14 3.1. Evolution de la maladie............................................................................. 14 3.2. Hépatite aiguë................................................................................................ 14 3.3. Hépatite chronique...................................................................................... 14 3.3.2.1. Facteurs liés à l'hôte.................................................................................. 15 3.3.2.2. Facteurs viraux.......................................................................................... 15 3.4. Manifestations extrahépatiques.............................................................. 16 4. Réponse immunitaire..................................................................................... 16 4.1. Réponse cellulaire......................................................................................... 17 4.2. Réponse humorale........................................................................................