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CARACTERISATION D'UN NOUVEAU GENE IMPLIQUE DANS LE PHENOTYPE ODONTOBLASTIQUE

De
41 pages
Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Emilie HEIDET Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes CARACTERISATION D'UN NOUVEAU GENE IMPLIQUE DANS LE PHENOTYPE ODONTOBLASTIQUE Soutenu le 23 janvier 2003 devant le jury suivant : Pr Jean-Marie EXBRAYAT – Président Dr Claire BELLATON – Rapporteur Dr Françoise BLEICHER – Examinateur Pr Henry MAGLOIRE – Examinateur Dr Patricia Rousselle - Examinateur EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • cellules du cerveau, des reins, des poumons, du foie et dans les cellules mg63

  • rt pcr

  • validation de la banque

  • cytodifférenciation des préodontoblastes en odontoblastes fonctionnels

  • cultures cellulaires

  • analyse de la séquence protéique

  • cellules pulpaires précurseurs

  • odontoblastes


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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE


ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
Sciences de la Vie et de la Terre


MEMOIRE


Présenté par
Emilie HEIDET

Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes





CARACTERISATION D’UN NOUVEAU GENE
IMPLIQUE DANS LE
PHENOTYPE ODONTOBLASTIQUE




Soutenu le 23 janvier 2003 devant le jury suivant :

Pr Jean-Marie EXBRAYAT – Président
Dr Claire BELLATON – Rapporteur
Dr Françoise BLEICHER – Examinateur
Pr Henry MAGLOIRE –
Dr Patricia Rousselle - Examinateur
















EPHE Banque de Monographies SVT 1ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES - SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

CARACTERISATION D’UN NOUVEAU GENE
IMPLIQUE DANS LE PHENOTYPE ODONTOBLASTIQUE

Emilie Heidet

Les odontoblastes, cellules post-mitotiques, synthétisent les composants de la prédentine-dentine
comprenant des collagènes, des glycoprotéines, des sialoprotéines, des phosprotéines et des
facteurs de croissance. De nombreuses protéines exprimées par les odontoblastes le sont aussi
par différentes cellules de l’organisme en particulier les ostéoblastes. Actuellement, seules deux
protéines sont connues pour être plus spécifiquement exprimées et sécrétées par les
odontoblastes : la phosphoprotéine dentinaire (DPP) et la sialoprotéine dentinaire (DSP), codées
par un gène unique. Le transcrit de ce gène donne naissance à une protéine précurseur : la
sialophosphoprotéine dentinaire (DSPP), qui va être clivée par la suite. Récemment, le transcrit de
la dspp a également été observé dans les cellules du tissu osseux et l’oreille interne de souris
mais à l’état de trace. Ces deux protéines restent pour le moment les deux seuls marqueurs de la
différenciation odontoblastique.

Ceci démontre que le phénotype odontoblastique est encore mal connu. L’étude de ces cellules in
vivo n’est pas évidente. Leur localisation (corps cellulaire en périphérie et prolongement séquestré
dans la dentine) et leur degré de différenciation posent des difficultés techniques pour obtenir des
cellules pures. Pour contourner ces barrières, le laboratoire a développé un système de culture
favorisant la différenciation des odontoblastes à partir de cellules pulpaires précurseurs. Les ARNs
totaux issus de ces deux types cellulaires ont servi à la construction d’une banque d’ADNc,
enrichie en gène spécifiques des grâce à la technique SSH-PCR. Après validation
de la banque, les gènes clonés ont été analysés. Cette recherche a montré qu’une cinquantaine
d’entre eux correspondaient à des gènes inconnus.
Notre choix s’est tourné vers le clone 114, exprimé plus spécifiquement dans les odontoblastes
que les cellules pulpaires précurseurs. L’hybridation in situ a montré que celui-ci était exprimé
spécifiquement dans les cellules odontoblastiques dans la pulpe dentaire humaine. Dans la
mâchoire de rat, cette étude a permis de mettre en évidence un gradient d’expression croissant
pour ce clone, lors de la différenciation des odontoblastes. Par RT-PCR, l’expression des transcrits
correspondants a été détectée dans les cellules du cerveau, des reins, des poumons, du foie et
dans les cellules MG63 (cellules d’ostéosarcome).

Les parties flanquant la séquence clonée ont ensuite été acquises en utilisant successivement les
techniques de RACE-PCR, alignement informatique et RT-PCR. Deux fragments ont été obtenus :
l’un de 2200 pb du côté 5’ du messager, l’autre de 1500 pb du côté 3’ du messager. Après
séquençage il a été possible de superposer la partie commune des deux fragments.

L’analyse de la séquence nucléotidique a permis de détecter un cadre de lecture ouvert de 2742
pb codant pour une protéine de 914 acides aminés. L’alignement de notre séquence protéique
avec les séquences des bases de données montre que celle-ci est très conservée chez la souris
et la drosophile. De plus, cette protéine présenterait des domaines transmembranaires et des
motifs TPR impliqués dans les intéractions protéine-protéine. Prochainement, un anticorps dirigé
contre la protéine sera synthétisé afin de la localiser précisément. A plus long terme, la réalisation
de souris knock-out pourra être envisagée pour étudier la fonction de cette protéine.

Mots clés : gène inconnu, phénotype odontoblastique, spécificité tissulaire, schéma d’expression,
EPHE Banque de Monographies SVT 2domaines transmembranaires, motifs TPR.



TABLES DES MATIERES


Titres et Travaux
Liste des Tableaux et Figures
Abréviations

INTRODUCTION 1

SITUATION DU SUJET 2

I –Formation de l’ébauche dentaire 2

I – 1 Origine embryonnaire des tissus dentaires 2

I – 2 Phase d’initiation 2

I – 3 Phase de morphogenèse 3

II – Différenciation terminale des odontoblastes 5

II – 1 Cytodifférenciation des préodontoblastes en odontoblastes fonctionnels 5

II – 2 Régulation de la différenciation odontoblastique 6

II – 2 – 1 Importance de la membrane basale 7
II – 2 – 2 Changement de composition de la membrane basale 8
II – 2 – 3 Activité biologique des constituants matriciels 9

II – 3 Rôle des odontoblastes : la dentinogenèse 10

II – 3 – 1 La prédentine 11
II – 3 – 2 La dentine 11
II – 3 – 3 La réactionnelle 12
II – 3 – 4 La dentine réparatrice 12

II – 4 Protéines dentinaires sécrétées par les odontoblastes 13

II – 4 – 1 Les collagènes 13
II – 4 – 2 Protéines non collagéniques exprimées par les odontoblastes
et les cellules de divers tissus 13
a. L’ostéonectine 13
b. L’ostéopontine 14
c. Les protéoglycanes 14
d. La phosphatase alcaline 15
EPHE Banque de Monographies SVT 3

II – 4 – 3 Protéines exprimées par les odontoblastes
et les cellules des tissus minéralisés 15
a. L’ostéocalcine 15
b. La protéine de la matrice dentinaire (DMP1 ou AG1) 15
c. La sialoprotéine osseuse (BSP) 15
II – 4 – 4 Protéines spécifiques des odontoblastes 16
a. La phosphoprotéine dentinaire (DPP) ou phosphoryne 17
b. La sialoprotéine (DSP) 17

III – Etude des odontoblastes 18

III – 1 Difficultés d’étude de ce type cellulaire 18

III – 2 Méthodes utilisées pour contourner les difficultés 18
III – 2 – 1 Cultures de papilles dentaires 18
III – 2 – 2 de tranches de dent 19
III – 2 – 3 Cultures de cellules pulpaires 20
III – 2 – 4 Microdissection à capture laser 21

III – 3 Techniques mises en œuvre dans notre laboratoire 21
III – 3 – 1 Culture cellulaire 21
III – 3 – 2 Construction d’une banque spécifique des odontoblastes 22

MATERIELS ET METHODES 24

I – Cultures cellulaires 24

II – Extractions des ARNs totaux des cellules en culture
24

III – Extraction des plasmides 25

IV – Mesures spectrophotométriques 26

V – Reverse northern dot-blotting 27

V – 1 Synthèse et marquage de sonde 27

32V – 1 – 1 Marquage au P et synthèse de la sonde 27
V – 1 – 2 Calcul de la radioactivité incorporée dans la sonde 27
V – 1 – 3 Purification de la sonde 29

V – 2 Hybridation 29

VI – RT-PCR 30

VI – 1 Rétrotranscription et amplification dans un même tube 31

VI – 2 et dans deux tubes séparés 31

VI – 2 – 1 Transcription inverse par le système RT-PCR
EPHE Banque de Monographies SVT 4TM « SuperScript II First-Strand Synthesis » (Invitrogen, CA, USA) 31
VI – 2 – 2 Amplification par le système PCR
« Expand High Fidelity » (Roche, Mannheim, Germany) 32
VI – 3 RT-PCR semi-quantitative 32

VII – Hybridation in situ 33

VII – 1 Préparation des coupes 33

33VII – 2 Synthèse et marquage au P de la sonde 34

VII – 3 Hybridation 35

VIII – RACE-PCR 5’ 36

TM VIII – 1 Utilisation du kit GeneRacer (Invitrogen, CA,USA)
36

VIII – 2 Utilisation du kit 5’/3’ Race (Roche, Mannheim, Germany)
39

IX – Purification d’acides nucléiques 41

IX – 1 Electroélution 41

IX – 2 Purification avec le kit Maestro Gelex (Eurobio, Les ulis France) 41

X – Séquençage 42

XI – Analyse informatique 43

XI – 1 Recherche d’amorces 43

XI – 2 Analyse de la séquence nucléique 43

XI – 3 Analyse de la séquence protéique 44

XI – 4 Recherche de séquences antigéniques 44

RESULTATS 45

I – Comparaison des clones de la banque soustractive avec
les séquences contenues dans les banques de données 45

II – Choix du clone à étudier parmi les gènes inconnus
45

II – 1 Etude de l’expression différentielle des clones inconnus
par reverse northern dot-blotting 45

II – 2 Etude de l’expression de différents clones
par RT-PCR semi-quantitative 46
EPHE Banque de Monographies SVT 5
III – Etude du clone 114 47

III – 1 Schéma d’expression du clone 114 47

III – 1 – 1 Au niveau la dent humaine 47
III – 1 – 2 Au de la mâchoire de rat 47

III – 2 Spécificité d’expression du clone 114 48

III – 3 Recherche de la séquence complète de l’ADNc correspondant au clone 114 49

III – 3 – 1 Etape de RACE-PCR 49
TMa. Utilisation du kit GeneRacer (Invitrogen) 49
b. du kit RACE5’/3’ (Roche) 49
III – 3 – 1 Alignement de la séquence AK023165 et choix d’amorces 51
III – 3 – 2 Amplification du transcrit 114 par RT-PCR 51

III – 4 Séquençage 52

III – 5 Analyse informatique de la séquence d’ADNc correspondant
au transcrit du clone 114 52

III – 5 – 1 Alignement de la séquence avec les entrées des banques 52
III – 5 – 2 Recherche de la protéique codée par notre gène 52
III – 5 – 3 de notre séquence avec le gène virtuel 52
III – 5 – 4 Analyse de la séquence protéique 52
III – 5 – 5 de la sur le site Ensembl 53
III – 5 – 6 Prédictions sur la destination finale
de la protéine codée par le clone 114 53
III – 5 – 7 Recherche de peptides antigéniques 54

DISCUSSION 55

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 61

BIBLIOGRAPHIE 62














EPHE Banque de Monographies SVT 6









ABREVIATIONS

[X] Concentration µl Microlitre
ADN Acide désoxyribonucléique ml Millitre
ADNc Acide complémentaire °C Degrè Celsius
ARN Acide ribonucléique
ARNm Acide messager
ARNt Acide ribonucléique de transfert
BSP Sialoprotéine osseuse
CCN Cellules de la crête neurale
Ci Curie
CIP Phosphatase intestinale de veau
DEPC diéthyl pyrophosphate
DMP1 Protéine de la matrice dentinaire 1
DPP Phosphoprotéine dentinaire
DSP Sialoprotéine dentinaire
Dspp Sialophosphoprotéine dentinaire
DO Densité optique
DTT Dithiothreitol
EDTA Acide éthylène diamine tétracétique
GAPDH Glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase
MB Membrane basale
MEC Matrice extracellulaire
32P Phosphore 32
33P 33
Pb Paire de base
PBS Tampon phosphate
Rpm rotation par minute
RT-PCR Retrotranscription-polymérisation en chaine
SDS Sodium dodécyl sulfate
SSC Citrate de sodium salin
SSPE phosphate de sodium salin-EDTA
EPHE Banque de Monographies SVT 7SVF Sérum de veau foetal
TAP Pyrophosphatase acide du tabac
TBE Tris-Borate-EDTA
TCA Trichloroacétate
U Unité
SVF Sérum de veau fœtal
βGP β-glycérophosphate


INTRODUCTION

Le développement des tissus dentaires est caractérisé par l’histomorphogenèse et la
cytodifférenciation d’un mésenchyme et d’un épithélium, ayant la capacité de donner naissance
respectivement aux cellules odontoblastiques et aux cellules améloblastiques. Les premières sont
responsables de la synthèse et la sécrétion des composants organiques de la prédentine/dentine
et les secondes à l’origine des composants de l’émail (Figure 1).
La mise en place des odontoblastes, à la périphérie de la pulpe, fait intervenir une succession
d’événements comprenant la migration et la distribution des cellules de la crête neurale (CCN)
dans la mâchoire en voie de formation, l’acquisition d’un potentiel odontogène par ces cellules,
leur spécification et enfin la différenciation terminale des préodontoblastes compétents en
odontoblastes fonctionnels. Les gènes impliqués dans le développement précoce des tissus
dentaires ont été largement étudiés et les mécanismes moléculaires intervenant dans la
différenciation terminale des odontoblastes commencent à être éclaircis.
En revanche, il existe peu d’informations sur les gènes cibles responsables du phénotype
odontoblastique. Actuellement, seules la sialoprotéine dentinaire (DSP) et la phosphoprotéine
dentinaire (DPP) sont connues pour être surexprimées par les odontoblastes. Afin d’approfondir
les connaissances sur ces cellules, nous avons choisi d’étudier un nouveau gène impliqué dans le
phénotype odontoblastique.
Pour répondre à cet objectif, le laboratoire a developpé un système de culture induisant la
différenciation de cellules pulpaires précurseurs humaines en odontoblastes. L’approche in vitro de
ces cellules est plus évidente que l’approche in vivo. Les odontoblastes sont des cellules post-
mitotiques organisées en monocouche à la périphérie de la pulpe, avec leur prolongement
enchassé dans la prédentine-dentine. L’obtention de cellules pures en quantité importante est
donc difficile.
Notre modèle de cultures a ainsi permis l’extraction d’ARNm en quantité suffisante à partir des
cellules pulpaires précurseurs et des odontoblastes, pour pouvoir utiliser des techniques de
biologie moléculaire. Les transcrits ont ensuite servi à la construction d’une banque enrichie en
gènes spécifiques des odontoblastes par la technique PCR d’hybridation soustractive suppressive
(PCR SSH). Après avoir validé la banque, les gènes ont été alignés avec ceux contenus dans les
banques de données grâce au logiciel BLAST. Ceci a permis de classer les gènes dans trois
EPHE Banque de Monographies SVT 8catégories : les gènes déjà identifiés dans les odontoblastes, les gènes identifiés dans d’autres
types cellulaires et les gènes inconnus. La forte proportion de cette dernière classe laisse penser
que tout reste à faire sur les gènes exprimés par les odontoblastes.



SITUATION DU SUJET

I – Formation de l’ébauche dentaire

Le développement dentaire résulte d’une suite d’interactions épithélio-mésenchymateuses (pour
revue Thesleff et Sharpe, 1997 ; Slavkin, 1974 ; Thesleff and Hurmerinka, 1981 ; Ruch, 1987)
entre un épithélium dérivé de l’ectoderme et un mésenchyme dérivé des cellules de la crête
neurale (CCN).
La transmission des signaux entre les deux tissus passe par l’expression de nombreux gènes de
types homéogènes, facteurs de croissances et gènes du développement. Ces interactions
réciproques et continues contrôlent la morphogenèse de l’épithélium et du mésenchyme dentaires,
ainsi que la cytodifférenciation des odontoblastes et des améloblastes.

I – 1 Origine embryonnaire des tissus dentaires

Des travaux d’ablations et de transplantations chez des embryons d’amphibiens ont révélés que le
mésenchyme dentaire, incluant les odontoblastes, dérivait de la crête neurale céphalique (Ruch,
1995 ; Maas et Bei, 1997 ; Graveson et al., 1997). En marquant les cellules de la crête neurale au
Dil, Imai et al. (1996) ont montré que celles-ci proviennent du mésencéphale postérieur et
rhombencéphale antérieur (essentiellement les rhombomères 1 et 2) (figure 2a).
Ces cellules vont se séparer du bord de la gouttière neurale au moment de sa fermeture et
entamer leur migration, pour aller coloniser le premier arc pharyngien (figure 2b), à l’origine de la
mandibule et du maxillaire.
Conjointement à leur migration, les CCN se transforment en cellules mésenchymateuses. Une fois
leur destination finale atteinte, certaines d’entre elles se différencieront en odontoblastes sous
l’influence de territoires spécifiques de l’épithélium oral (figure 2c).

I – 2 Phase d’initiation

La première manifestation morphologique du développement dentaire au niveau mandibulaire et
maxillaire apparaît, chez la souris , au jour embryonnaire 11 (E11). L’épithélium buccal s’épaissit
conduisant à la formation de la « lame dentaire » dans des régions spécifiques : c’est la phase
EPHE Banque de Monographies SVT 9d’initiation (Figure 3A). Celle-ci détermine le site de développement de la dent au niveau de la
mâchoire (Tucker et Sharpe, 1999), par conséquent elle détermine aussi son identité.

Au départ, le pouvoir odontogène (capacité à induire la formation d’une dent) est détenu par
l’épithélium oral. Il va jouer son rôle en exprimant un certain nombre de gènes tels que Pitx2
(Amand et al., 2000) ainsi que les gènes codant de nombreux facteurs de croissance tels les
BMPs (bone morphogenetic protéine), FGFs (fibroblast growth factor), et des gènes du
développement comme shh (sonic hedgehog) et Wnt (Wint) (Figure 4) (Jernvall et Thesleff, 2000 ;
Chen et al., 1996).

Lorsque l’épithélium a joué son rôle initiateur, l’ectomésenchyme prend un rôle dominant dans les
relations épithélio-mésenchymateuses.
Il va agir sur l’épithélium en exprimant à son tour différents facteurs de transcription codés par les
homéogènes Msx1,-2 (Mackensie et al., 1991 ; 1992 ; Tureckova et al., 1995); Dlx1,-2 (Dolle et
al., 1992 ; Robinson et Mahon, 1994 ; Qiu et al., 1995 ; Weiss et al., 1998 ; Ferguson et al., 2000)
; Barx 1 (Tissier-Seta et al., 1995) ; Pax 9 (Peter et Balling, 1999); Gli1,-2,-3 (Hardcastle et al.,
1998) ; Lhx6,-7 (Grigoriou et al., 1998) ainsi que les facteurs de croissance BMP2 et BMP4 (Figure
4).

I – 3 Phase de morphogenèse

A ce stade, l’ectomésenchyme a un rôle dominant dans les relations épithélio-mésenchymateuses
(Kollar et Baird, 1970a ; 1970b). Son influence va induire la formation de l’invagination épithéliale,
qui va acquérir progressivement une morphologie spécifique de chaque dent. Cette phase est
subdivisée en 3 stades :

- Stade du bourgeon
- Stade de la cupule
- Stade de la cloche.

Stade du bourgeon :

A ce stade (jour embryonnaire 13,5), les cellules de chaque lame prolifèrent et donnent naissance
à un renflement épithéliale : le bourgeon dentaire. En regard de cette structure, les cellules de
l’ectomésenchyme se condensent (Figure 3B)

Pitx2 est toujours exprimé par les cellules de la lame dentaire. Dans la zone centrale du bourgeon,
un sous-ensemble de cellules expriment de manière intense les facteurs de croissance de quatre
familles (BMP, FGF, Hh, Wnt) dont BMP4 et FGF8 ainsi que d’autres d’autres gènes tels que p21,
Msx2 et Lef1 (Jernvall et Thesleff, 2000).
EPHE Banque de Monographies SVT 10