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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE   ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre    MEMOIRE  Présenté par  Aurélien DENES  Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes   ETUDE COMPARÉE DE L’EFFET DE DEUX PROTÉASES SUR LA PRODUCTION D'HYDROLYSATS DOTÉS D'ACTIVITÉS ANTIOXYDANTE ET ANTIRADICALAIRE.   Soutenu le 29 décembre 2006 :   Devant le jury suivant :  - Madame Jeanine LE RHUN -Président de jury - Monsieur Alain VAN WORMHOUDT -Examinateur - Madame Fabienne GUERARD -Examinateur - Madame Rozenn RAVALLEC-PLE –Examinateur et rapporteur    Laboratoire EPHE Evolution Moléculaire et Adaptation Directeur : Dr A. Van Wormhoudt Station de Biologie Marine (avw@mnhn.fr) BP 225 29182 CONCARNEAU  Laboratoire d'accueil                                                        ANTiOX – Universitéde Bretagne Occidentale Directrice et Maître de stage : Pôle universitaire P.J. Helias Dr F. Guérard Creac’h Gwen (Fabienne.Guerard@univ-brest.fr) 29000 QUIMPER RÉSUMÉ     L’objectif de ce mémoire est la production d’hydrolysats de filets de lieu noir dotés d’activités antioxydante et antiradicalaire, ceci à l’aide de protéases commerciales dont les activités enzymatiques ont été préalablement standardisées. Les hydrolysats de protéines de poisson présentent un intérêt en raison de leurs propriétés fonctionnelles et biologiques. Au cours des dernières années, un grand nombre d’hydrolysats
générés à partir de co-produits de la pêche ont montré diverses activités: hormonales, stimulatrices de croissance, immuno-modulatrices, anti-hypertensives, antioxydantes.             La standardisation des activités enzymatiques a été mise au point sur un substrat caséine et a permis de sélectionner deux préparations enzymatiques commerciales pour la suite de l’étude : l’Alcalase®2.4 L et l’Espérase®8.0 L. Des hydrolyses contrôlées en réacteur enzymatique ont été réalisées sur le lieu noir dans les conditions optimales d’activité des enzymes utilisées, soit à pH 8 et 55°C. Les cinétiques ont été suivies pour différents ratios Enzyme/Substrat (E/S) par l’évaluation du degré d’hydrolyse (DH %) selon la méthode du pH-stat. Les DH pH-stat (%) obtenus avec l’Alcalase®2.4 L sont légèrement supérieurs à ceux obtenus avec l’Espérase®8.0 L. Une étude comparative du calcul du DH par deux autres méthodes a montré que la méthode à l’ortho-phtaldialdéhyde (OPA) permet d’obtenir des valeurs de DH proches des valeurs du DH pH-stat, les valeurs du DH Kjeldahl étant plus élevées. Une étude mécanistique des facteurs limitants de l’hydrolyse a ensuite été initiée pour expliquer l’allure des courbes d’hydrolyse obtenues. Il en ressort que le substrat est le principal facteur limitant de l’hydrolyse. Une légère désactivation des deux enzymes ainsi qu’une faible inhibition de ces deux enzymes par les produits de l’hydrolyse sont également observées.  Les profils chromatographiques obtenus à l’aide de l’exclusion stérique (SEC-FPLC) ont permis de confirmer les différences de DH observées pour les deux enzymes étudiées. Comparativement à l’Espérase® 8.0 L, l’Alcalase® L permet en effet d’obtenir une hydrolyse plus poussée et donc une proportion plus 2.4 importante en peptides de faible poids moléculaire. Les activités antiradicalaires évaluées à l’aide du test au DPPH.10 %). Inversement, les activités antioxydantes évaluées par le test au ène –sont faibles (inférieures à acide linoléique sont élevées et se situent en moyenne entre 60 et 65 %. L’influence des paramètres de l’hydrolyse (temps de réaction, ratio Enzyme/Substrat) sur les activités biologiques obtenues n’a pas pu être mise en évidence. Cependant, les valeurs d’activité du blanc d’hydrolyse (sans enzyme) se sont avérées nulles, on peut en conclure que les activités obtenues ici sont donc exclusivement dues à l’hydrolyse enzymatique.  Ces hydrolysats dotés activités biologiques voient leur intérêt croître et se retrouvent de plus en plus sur des marchés en plein essor comme la nutraceutique, les aliments fonctionnels ou bien la cosmétologie.    MOTS-CLES : AlcalaseHydrolyse enzymatique, degré d’hydrolyse,® L, Espérase 2.4® 8.0 L, activité antioxydante, peptides, lieu noir, chromatographie d’exclusion stérique.   
TABLE DES MATIERES   TABLE DES MATIERES....................................................................................................... 3 LISTE DES ABREVIATIONS.............................................................................................. 5 INTRODUCTION................................................................................................................... 6  ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.............................................................................................. 8 I. La valorisation des co-produits de la pêche..................................................................... 8 I.1. Etat des lieux................................................................................................................ 8 I.2. Les différentes voies de valorisation des co-produits................................................ 8 I.3. Les principales applications des hydrolysats............................................................ 9 I.3.1. L’alimentation......................................................................................... 9 I.3.2. Les peptones.......................................................................................... 10 II. L’hydrolyse des protéines.............................................................................................. 10 II.1. Les différents types d’hydrolysats enzymatiques................................................. 11 II.1.1. Les produits fermentés et les autolysats............................................... 11
II.1.2. Les hétérolysats................................................................................... 11 II.2. La classification des enzymes.................................................................................. 11 II.2.1. Les endopeptidases.............................................................................. 12 II.2.2. Les exopeptidases................................................................................ 12 II.3. L’utilisation d’enzymes exogènes............................................................................ 12 II.3.1. Les enzymes d’origine végétale............................................................ 13 II.3.2. Les enzymes d’origine animale............................................................ 13 II.3.3. Les enzymes d’origine microbienne..................................................... 13 II.4. L’activité enzymatique............................................................................................. 14 II.5. Caractérisation de l’hydrolysat............................................................................... 15 II.5.1. Le degré d’hydrolyse........................................................................... 15 II.5.2. La caractérisation des hydrolysats par chromatographie................... 16 III. L’activité antioxydante et antiradicalaire................................................................... 17 III.1. Les radicaux libres.................................................................................................. 17 III.1.1. Production endogène.......................................................................... 17 III.1.2. Production exogène............................................................................ 18 III.2. Le stress oxydatif.................................................................................................... 18 III.3. Les moyens de défense contre les radicaux libres................................................ 20 III.3.1. Moyens endogènes.............................................................................. 20 III.3.2. Moyens exogènes................................................................................ 20 III.4. Les antioxydants..................................................................................................... 20 III.4.1. Mode d’action des antioxydants......................................................... 20 III.4.2. Antioxydants naturels et de synthèse................................................... 21 III.4.3. Les peptides antioxydants et antiradicalaires d’origine marine......... 22 III.5. L’évaluation de la capacité antioxydantein vitro................................................. 24
 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................ 27        
AAO : Activité antioxydante AAR Activité antioradicalaire : AC 50                     : Concentration en protéines qui permet d’obtenir 50 % d’activité antioxydante AGPI: Acide gras poly-insaturé            ASC : Aire sous la courbe ASR Analyse de surface de réponse : BHA Butylated hydroxyanisole : B : Butylated ydrotoluene HTh CAT: Catalase DH Degré d’hydrolyse : DPPH 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl : EC Enzyme commission : ERO Espèces Réactives de l’Oxygène : E/S sur substrat Ra enz :
FPC Fish protein concentrate : FPH : Fish protein hydrolysate GPX: Glutathion peroxydase               HAT: Hydrogen atom transfer OPA : Ortho-Phtaldialdéhyde PM Poids moléculaire : SEC : Size exclusion chromatography SET: Single electron transfer SOD: Superoxyde dismutase TCA Acide trichloroacétique : TNBS : Acide trinitrobenzenesulfonique TROLOX : Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tetraméthylchroman-2-carboxylique UA: Unité arbitraire UT: Unité tyrosine
    INTRODUCTION  Les ressources mondiales extraites du milieu aquatique représentent plus de 130 millions de tonnes par an. Suivant les espèces considérées et le mode de transformation adopté, ces ressources générent par année de 30 à 85 % de déchets appelés co-produits (têtes, peaux, viscères…) (FAO-Sofia 2004).  Les nouvelles contraintes de gestion des ressources halieutiques imposent d’adopter de nouvelles stratégies de valorisation des co-produits. Actuellement, ces derniers sont principalement transformés en farine et en huile mais c’est une transformation à faible valeur ajoutée. Aussi, le circuit d’élimination des co-produits de la filière pêche et aquaculture en France a subi de fortes perturbations depuis l’année 2000, notamment liées aux répercussions des difficultés apparues dans les filières animales (encéphalopathie spongiforme bovine, dioxines). L’amélioration des performances économiques de la filière à travers une meilleure valorisation s’avère donc nécessaire (OFIMER, 2004).  L’hydrolyse enzymatique appliquée aux co-produits marins dans le but de produire de nouveaux actifs constitue l’une des voies possibles pour mieux valoriser ces ressources. Ce procédé permet la récupération de protéines qui conservent leur teneur en acides aminés essentiels et sont susceptibles de posséder des fonctions biologiques. Ce travail s’inscrit dans une approche innovante par rapport aux travaux antérieurs de valorisation de la biomasse d’origine marine, qui portaient principalement sur les aspects nutritionnels et fonctionnels des hydrolysats.  Ce mémoire a donc pour objectif la production d’hydrolysats de filets de lieu noir dotés d’activités antioxydante et antiradicalaire, ceci à partir de protéases commerciales préalablement standardisées sur un substrat caséine. Le choix de filets de lieu noir comme modèle se justifie par une réalité industrielle de valorisation des carcasses de poisson obtenues après les procédés de filetage.  L’hydrolyse enzymatique préalable sur un substrat caséine permet de standardiser les activités enzymatiques des préparations commerciales utilisées avant les hydrolyses sur le lieu noir. Ainsi, les unités d’expression de l’activité enzymatique sont établies à partir d’une même base de référence. La grande majorité des travaux actuels sur le sujet ne relate qu’une comparaison des protéases entre elles selon le poids ou le volume utilisé, ce qui n’est pas très réaliste. En effet, les unités d’expression de l’activité enzymatique employées par les différents fournisseurs varient selon les enzymes et les conditions opératoires.  Les hydrolyses sur le lieu noir ont été réalisées à partir de deux préparations commerciales : l’Alcalase®2.4 L et l’Espérase®8.0 L. Leur suivi a été réalisé par l’évaluation du degré d’hydrolyse (DH %) selon la méthode du pH-stat. Cette méthode a été comparée avec celle de Kjeldahl et celle à l’ortho-phtaldialdéhyde (OPA). Une étude mécanistique des facteurs limitants de l’hydrolyse a ensuite été initiée pour expliquer l’allure des courbes d’hydrolyse obtenues.  La caractérisation des hydrolysats par chromatographie d’exclusion stérique (SEC-FPLC) a permis
d’obtenir la répartition des peptides produits suivant leur poids moléculaire. L’activité antiradicalaire a été déterminée à l’aide du test au DPPH.à partir du test au ène – acide linoléique. l’activité antioxydante  et L’influence des paramètres de l’hydrolyse (temps de réaction, ratio Enzyme/Substrat) sur ces activités a été étudiée. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE   I. La valorisation des co-produits de la pêche  I.1. Etat des lieux  Lesressources mondialesextraites du milieu aquatique représentent plus de 130 millions de tonnes par an : environ 100 millions de tonnes sont issues du milieu marin et environ 30 millions de tonnes sont issues de l’eau douce ; ces deux domaines comprenant chacun captures et aquaculture. La quantité dedéchets de ressource est estimée entreque peuvent générer par an ces 130 millions de tonnes 30 et 85 % suivant les espèces considérées et le mode de transformation adopté (FAO-Sofia 2004).  On nommeco-produitsde la transformation de la matière première, ceux-ciles déchets solides issus incluant : les têtes, les viscères, la peau, les arêtes, la chair restante sur les carcasses, les chutes de filetage, les carapaces, les coquilles etc… En France, le tonnage brut de poissons donnant lieu à des co-produits a été estimé à 320 000 T en 2002. Le tonnage correspondant de co-produits a été estimé à 150 000 T, soit 47 % du tonnage brut (OFIMER, 2004).  En situation de rareté durable de la ressource, il est regrettable que les co-produits soient dans leur ensemble si peu valorisés. Aussi, le circuit d’élimination des co-produits de la filière pêche et aquaculture en France a subi de fortes perturbations depuis l’année 2000, notamment liées aux répercussions des difficultés apparues dans les filières animales (encéphalopathie spongiforme bovine, dioxines). L’amélioration des performances économiques de la filière à travers une meilleurevalorisationdes co-produits générés par les activités de mareyage, conserverie et saurisserie est donc nécessaire (OFIMER, 2004).   I.2. Les différentes voies de valorisation des co-produits  Aujourd’hui, en France, la pêche et l’aquaculture valorisent la quasi-totalité de leurs co-produits vers des utilisations de faible valeur ajoutée : 96 % des co-produits d’origine aquatique générés en France font l’objet d’une valorisation de masse sous forme de farine et d’huile (52 %), d’hydrolysats de protéines (21 %), de hachis congelés (23 %), et divers (4 % : production d’aromes, de gélatine, de collagène, de chondroïtine-sulfate, de cuir…) (OFIMER, 2004). Les composés à forte valeur ajoutée représentent donc moins de 10 % du marché.  Traditionnellement, la plupart des co-produits de l’industrie de la pêche a été convertie en huile ou en farine de poisson par un procédé combinant la cuisson, la séparation des solubles et des insolubles, la concentration des solubles et la déshydratation des insolubles (Benjakulet al., 1997). Leshuiles marines, riches en acides gras essentiels, deviennent de plus en plus recherchées dans les domaines pharmaceutiques, de l'industrie cosmétique, et en tant que compléments alimentaires. Les farines ou concentrés protéiques de poisson (Fish Protein Concentrates ouFPC) possèdent de bonnes valeurs nutritives et une grande teneur en acides aminés essentiels mais sont peu solubles et possèdent peu de propriétés fonctionnelles. Ils sont couramment utilisés en alimentation animale comme compléments protéiques mais peuvent causer des inconvénients liés à leur forte teneur en sels minéraux et nécessitent par ailleurs de gros investissements et une consommation importante d’énergie. Ils constituent donc une voie de valorisation à faible valeur ajoutée.  L’image positive des produits marins et le dynamisme de la recherche dans le secteur permettent d’envisager un bon positionnement des filières pêche et aquaculture dans les marchés de la cosmétique, de la diététique et de la nutraceutique. Les avancées scientifiques sur la composition chimique des co-produits et en particulier sur le process d’hydrolyse enzymatique laissent entrevoir de nouvelles voies de valorisation à plus forte valeur ajoutée : extraction de lécithines marines, de peptones (pouvant constituer des substrats azotés pour la culture bactérienne) et de nombreuses substances bioactives intéressantes (OFIMER, 2004). Ces hydrolysats de protéines de poisson (FPH ou Fish Protein Hydrolysates) peuvent être déshydratés : on obtient alors une poudre contenant une forte teneur en protéines et présentant comparativement aux FPC une
meilleure stabilité, de meilleures propriétés fonctionnelles, une meilleure solubilité dans l’eau, et des propriétés émulsifiantes. Les coûts de production sont sensiblement supérieurs dans le cas des hydrolysats et les rendements sont légèrement inférieurs en raison de l’élimination des résidus d’arêtes insolubles, mais la valeur ajoutéeest beaucoupplus élevée.   I.3. Les principales applications des hydrolysats                                                 I.3.1. L’alimentation   Les hydrolysats protéiques de poisson peuvent être utilisés enalimentation humaine ouanimale   pour leurspropriétés aromatiques, fonctionnelles ou nutritionnelles.  Ø     notamment dans les soupes de poissonsLes hydrolysats peuvent être utilisés comme base aromatique, et de crustacés. Les petits peptides et les acides aminés jouent un rôle important dans la saveur du produit.  Ø    Les propriétés fonctionnelles recherchées pour la formulation d’un aliment sont la solubilité, la dispersabilité, les capacités moussantes et émulsifiantes et le pouvoir de rétention de l’eau et des matières grasses. Ces différentes propriétés sont dues à 3 effets distincts qui accompagnent l’hydrolyse : la diminution du poids moléculaire, l’augmentation du nombre de groupes ionisables et l’exposition de groupes hydrophobes jusqu’ici dissimulés (Panyam et Kilara, 1996).  Ø    protéiques en alimentation animale et humaine. IlsLes hydrolysats peuvent servir de compléments permettent une meilleure assimilation des acides aminés. De plus, leur teneur en acides aminés essentiels est supérieure ou égale à celle de la protéine standard du FAO/WHO (Barzana et Garcia-Garibay, 1994 cités par Diniz et Martin, 1997 b).  Ø    En alimentation humaine, en 1990, Yuet al.ont démontré que l’utilisation d’hydrolysats de protéines d’Oreochromis mossambicusles crackers (biscuits secs salés) améliore l'apparence, ledans croustillant et la couleur. En 1992, des biscuits de poisson ont été développés pour compléter l’apport en protéines nécessaires aux enfants dans les régions économiquement pauvres sur la côte Est de la péninsule Malaisienne (Yuet al.). En 1994, un hydrolysatd’Aristichthys nobilisséché est proposé pour son utilisation comme supplément de protéine dans des produits alimentaires populaires chinois comme des crackers de poisson, des nouilles de poisson et des boules de poisson (Yuet al.,1994). A noter par ailleurs, que pour la FAO, un hydrolysat de protéines de poisson utilisable dans la consommation humaine ne doit pas contenir plus de 0,5 % de lipides (w/w) dans le produit fini.   I.3.2. Les peptones  Les peptones sont des fractions d’hydrolysats non coagulables et non précipitables à la chaleur, ce qui permet leur utilisation en microbiologie. La croissance du domaine des biotechnologies ces dernières années a entraîné une demande plus forte concernant les milieux de culture en microbiologie. Jusqu’à présent, la caséine et les déchets d’abattoirs représentaient les seules principales sources de peptones de haute qualité. Les différents travaux utilisant des protéines de poisson hydrolysées dans des milieux de culture de microorganismes font tous état d’une diminution du temps de latence ou d’une augmentation de la biomasse obtenue. Les peptones de poisson, grâce à leur bonne valeur nutritionnelle, se retrouvent aujourd’hui de plus en plus référencées dans les catalogues des fournisseurs (Dufosséet al.,1997).   II. L’hydrolyse des protéines  L’hydrolyse est une approche alternative pour réhabiliter les co-produits d’origine marine et qui permet d’obtenir à partir de ceux-ci des produits pouvant présenter de nouvelles propriétés fonctionnelles et/ou biologiques.  L’hydrolyse des protéines peut être obtenue par deux méthodes : l’hydrolysechimique ou enzymatique(Guérardet al., 2005).  
§       L’hydrolyse des protéines par des produitschimiquesforts ou des solvants (acides ou basiques) est souvent réalisée dans des conditions drastiques : elle est améliorée à des températures, pressions et pH élevés. Une hydrolyse chimique ne peut pas être contrôlée. On obtient donc généralement un mélange d’acides aminés libres, ayant une valeur nutritionnelle réduite et de faibles propriétés fonctionnelles. Ces produits jouent alors plutôt le rôle d’exhausteurs de flaveur et de goût pour la viande, les gâteaux secs ou les soupes (Kristinssonet al., 2000a). Après acidification, l’hydrolysat acide est neutralisé, ce qui a pour conséquence la présence d’une forte concentration en sels dans le produit final qui devient alors difficilement tolérable en bouche. L’hydrolyse acide détruit également le Tryptophane.  Dans le cas de l’hydrolyse alcaline, des réactions délétères sont observées au cours de l’hydrolyse alcaline telles que la racémisation des L-acides aminés en D-AA non absorbés par l’homme, la formation de liaisons disulfures, la destruction de certains acides aminés (Cystéine, Cystine, Arginine, Méthionine). Un avantage cependant : le collagène présente une solubilité élevée en milieu basique.  §       Lors de l’hydrolyse enzymatique, enliaisons peptidiques des protéines sont clivéesles  milieu aqueux, la réaction étant catalysée par des protéases. Un équivalent d’un groupement a-carboxyl ainsi qu’un groupe a-aminé est formé par le clivage d’un équivalent d’une liaison peptidique. A noter que les peptides nouvellement formés peuvent être de nouveaux substrats pour l’enzyme (Adler-Nissen, 1976).  
 
                                     II.1. Les différents types d’hydrolysats enzymatiques  La production d’hydrolysats de protéines de poisson peut être réalisée de deux manières différentes (Roy et Durand, 1997). D’une part, on trouve des hydrolysats traditionnels avec les produits fermentés et les autolysats ; et d’autre part, on trouve les hétérolysats.  II.1.1. Les produits fermentés et les autolysats  Les produits fermentés et les autolysats font intervenir dans le processus de transformation les enzymes endogènes présentes dans les produits de départ.  §   poisson, puisqu’elle permet de fermentation est un moyen traditionnel utilisé pour conserver le La limiter certaines proliférations bactériennes par addition de sel ou de sucre. Elle permet en revanche le développement de bactéries lactiques. Les protéines sont hydrolysées par les enzymes endogènes et les bactéries naturellement présentes dans le mélange (Ockerman, 1992).  §       Les autolysats sont élaborés en plusieurs étapes à partir de poissons entiers ou de viscères. L’autolyse est réalisée par les enzymes endogènes, principalement les protéases digestives (pepsine, trypsine, chymotrypsine) ainsi que par les enzymes tissulaires (enzymes lysosomales ou catepthiques).  Le produit résultant de ces deux techniques est généralement un liquide assez visqueux riche en acides aminés libres et en petits peptides. Ce produit traditionnel est à la base de l’alimentation de certaines populations du sud-est asiatique appréciant les aliments à goût de poisson prononcé : le Nuoc-mam ou sauce de poisson saumuré (Viet-nam), le Nam-pla (Thaïlande), le Mam-tom (Chine), le Shiokara (Japon)…  II.1.2. Les hétérolysats  Les hétérolysats sont des hydrolysats obtenus à l’aide de différentes préparations enzymatiques commerciales et dans des conditions contrôlées permettant d’améliorer les propriétés fonctionnelles du
produit tout en conservant sa valeur nutritionnelle (Shahidi, 1995). Le paragraphe II.3 nommé "l’utilisation d’enzymes exogènes" développe cette partie.   II.2. La classification des enzymes  Les enzymes utilisées pour l’hydrolyse des protéines sont classées en tant que protéases et se voient attribuer les nombres E.C 3.4. dans la classification internationale « Enzyme Commission ». Dans l’hydrolyse enzymatique, le taux de clivage des liaisons peptidiques dépend principalement de deux facteurs: la spécificité de l’enzyme et l’accessibilité aux liaisons peptidiques (Adler-Nissen, 1986). Parmi les enzymes protéolytiques nommées protéinases, protéases, ou peptidases, on retrouve deux groupes : les endopeptidases et les exopeptidases.                                               II.2.1. Les endopeptidases   Elles agissent au coeur de la chaîne protéique, coupant la protéine en fragments plus petits. La liaison entre deux acides aminés adjacents dans la séquence primaire est rompue donnant ainsi naissance à deux peptides. Ces enzymes sont classées selon leur mécanisme catalytique: sérine, cystéine (thiol), acide aspartique et métallo-endopeptidases. Les endopeptidases sont les enzymes les plus utilisées pour l’hydrolyse des protéines alimentaires de par leur plus large spécificité (Kristinsson et Rasco, 2000a).  II.2.2. Les exopeptidases   Ces enzymes hydrolysent les liaisons peptidiques par les extrémités libres de la chaîne protéique. En effet, elles ont besoin d’un groupe aminé ou carboxyle terminal libre dans le substrat pour libérer des acides aminés ou des petits peptides (2-3 acides aminés), elles sont alors nommées respectivement aminopeptidases ou carboxypeptidases. Les exopeptidases sont classées selon leur mode d’action. Elles peuvent par ailleurs être combinées aux endopeptidases pour réaliser une dégradation plus complète. En effet, ceci permet de dégrader les petits peptides hydrophobes à l’origine de l’amertume des hydrolysats en acides aminés libres moins amers (Stevensonet al., 1998).             II.3. L’utilisation d’enzymes exogènes  Les différentes enzymes mises en jeu lors de la préparation des hydrolysats enzymatiques sont principalement des enzymes d’origine commerciale (enzymes exogènes), ajoutées à la préparation afin d’accélérer le processus d’hydrolyse. Ce sont ces dernières qui nous intéressent ici.  L’hydrolyse accélérée utilisant une enzyme unique ou un mélange de protéases commerciales présente de nombreux avantages tels que le contrôle de l’hydrolyse et des propriétés de l’hydrolysat, et l’utilisation d’une température de catalyse modérée (Diniz et Martin, 1996). L’hydrolyse enzymatique permet, en effet, d’obtenir des produits protéiques solubles avec de bonnes propriétés fonctionnelles (sans détériorer leurs valeurs nutritives) et susceptibles d’être utilisés en alimentation humaine ou animale. Elle permet également de contrôler la formation de peptides amers et de maintenir une qualité uniforme et une reproductibilité du produit (Liceaga-Gesualdoet al., 1999).  L’utilisation d’enzymes exogènes augmente aussi de manière significative la quantité de protéines libérées en comparaison avec l’autolyse. Shahidiet al. (1995) rapportent que l’utilisation d’enzymes endogènes pour hydrolyser du capelan (Mallotus villosus) permet de libérer 22,6 % de protéines, alors que l’hydrolyse par l’Alcalase®2.4 L aboutit à la libération de 70,6 % de protéines.  L’hydrolyse enzymatique est une méthode appropriée pour la préparation de peptides à façon, non seulement à cause de la disponibilité d’enzymes à grande échelle et à des coûts de plus en plus modérés, mais aussi grâce à la grande qualité de ces produits. Un avantage très important est la possibilité de pouvoir diriger l’hydrolyse vers des peptides particuliers souhaités en utilisant des enzymes avec des spécificités déterminées. L’hydrolyse enzymatique est aussi sous l’influence d’autres paramètres de contrôle tels que la température, le pH, le ratio Enzyme/Substrat (E/S) et le temps d’hydrolyse (Liasetet al.,2000).  II.3.1. Les enzymes d’origine végétale   Lesprotéases d’origine végétale les plus connues sont la papaïne, la bromélaïne, et la ficine. Ces  
protéases permettent d’obtenir des hydrolysats de bonne qualité mais leur production dépend de nombreux facteurs externes tels que les conditions de culture, le cycle de croissance, les recommandations climatiques, ce qui peut susciter des problèmes de coût et d’approvisionnement. Ces enzymes ne sont pas spécifiques. La ficine s’avère peu stable dans le temps. La papaïne, plutôt adaptée à des protéines prédigérées, peut conduire au stade acide aminé libre et poser des problèmes d’amertume (Durand, 1982).  II.3.2. Les enzymes d’origine animale  Lesenzymes d’origine animale (porcine et bovine) sont principalement la trypsine, la chymotrypsine, issues du pancréas et la pepsine, issue de la muqueuse gastrique. Ces trois enzymes sont des endoprotéases présentant des spécificités différentes. La trypsine a une affinité pour la lysine et l’arginine, la chymotrypsine pour les acides aminés aromatiques (Phe, Tyr, Trp) et la pepsine principalement pour les acides aminés hydrophobes (Alder-nissen, 1982). La pepsine est l’enzyme d’origine animale la plus largement utilisée. Son utilisation à pH acide présente l’avantage de limiter la contamination microbienne mais l’étape de neutralisation entraîne de hautes teneurs en cendres préjudiciables pour déboucher sur la production de peptones (Dufossé et al., 1997). De plus, la pepsine peut conférer un goût amer aux hydrolysats (De geroet al., 1971).  II.3.3. Les enzymes d’origine microbienne  Lesenzymes microbiennes plusieurs avantages par rapport aux enzymes présentent d’origine animale ou végétale : leurs types d’activité catalytique sont plus variés, leur stabilité face aux variations de température et de pH est meilleure. De ce fait, elles représentent aujourd’hui environ 90 % des enzymes produites pour les procédés industriels.            L’hydrolyse par l’Alcalase® L a été étudiée par  2.4 est bien souventde nombreux auteurs et son efficacité meilleure que celle des autres enzymes.   Quaglia et Orban (1987) ont étudié l’hydrolyse de sardine par l’Alcalase® 2.4 L, la papaïne et la neutrase dans leurs conditions optimales de pH et de température. Il s’est avéré que l’Alcalase®2.4 L et la papaïne permettent d’obtenir les meilleurs résultats en terme de rendement en azote. Les hydrolysats possèdent de fortes teneurs en protéines, de bonnes valeurs nutritionnelles et une bonne solubilité.   Benjakulet al.(1997) ont défini les conditions optimales pour hydrolyser des déchets de merlan par la Neutrase et l’Alcalase®2.4 L. Cette dernière est la plus efficace et permet d’atteindre, dans ses conditions optimales, un degré d’hydrolyse de 60 % et un rendement en azote de 70 %.   Martin et Porter (1995) ont mis au point les différents paramètres (température, temps d’hydrolyse, pH, ratio enzyme/substrat) de l’hydrolyse du capelan mâle entier par l’Alcalase® L. Ils ont obtenu un 2.4 hydrolysat riche en protéines, pauvre en lipides et à faible odeur.            Hoyle et Merritt (1994) ont hydrolysé du hareng par l’Alcalase®2.4 L et la papaïne. L’Alcalase®2.4 L permet d’obtenir un meilleur degré d’hydrolyse avec une amertume plus faible.   Diniz et Martin (1997b) ont optimisé l’hydrolyse de roussette par l’Alcalase®2.4 L en modélisant le degré d’hydrolyse (DH) en fonction de trois paramètres : pH, température et ratio enzyme/substrat. Un DH avoisinant les 19 % est obtenu avec un ratio enzyme/substrat de 3,6 % à 56°C et à pH 8,3.   Guérardet al., en 2001 et en 2002, ont utilisé respectivement l’Alcalase® L et l’Umamizyme 2.4® pour l’hydrolyse de co-produits de thon tropical. Ils montrent que les deux enzymes ont une efficacité proche mais que l’Alcalase®2.4 L présente une meilleure stabilité face à la température et une plus faible sensibilité face à l’inhibition par les peptides solubilisés au cours de l’hydrolyse.   II.4. L’activité enzymatique   Les activités enzymatiques déclarées par les fournisseurs sont souvent obtenues dans des conditions différentes des conditions opératoires utilisées par les chercheurs. Ces derniers déplorent d’ailleurs le fait que les activités enzymatiques déclarées ne le sont alors qu’à titre indicatif (Kristinsson et Rasco, 2000a).
  Comparer l’activité des enzymes en fonction du volume ou du poids ajouté n’a aucune réalité. En effet, les activités enzymatiques rapportées à la quantité d’enzyme utilisée diffèrent selon les enzymes et les conditions opératoires. Un certain nombre de méthodes ont donc été développées pour standardiser les activités enzymatiques à partir d’un substrat défini, et ce, avant les hydrolyses sur le substrat d’intérêt.  La méthode la plus ancienne utilise comme substrat lacaséine ou l’hémoglobine. L’hydrolyse peut être réalisée dans les conditions de pH et de température souhaitées sauf au pHi du substrat. La détermination de l’activité catalytique se fait par dosage (Lowry) des acides aminés Tyrosine libérés dans le surnageant au cours de l’hydrolyse. Une unité d’activité correspond alors à la quantité d’enzyme nécessaire pour produire en une minute et dans des conditions précises (pH et température) un hydrolysat dont l’absorbance àXnm est la même qu’une solution de tyrosine contenantYµg (ou µmol) de tyrosine par mL.  Il existe également une méthode colorimétrique utilisant despeptides p-Na(para-nitroanilide) et une méthode fluorimétrique utilisant despeptides-AMC(aminométhylcoumarine) comme substrats. L’utilisation de cette dernière méthode dépend de l’activité que l’on veut mettre en évidence (exemple : Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC pour une activité endoprotéinase ; Leu-AMC, Ala-AMC, Gly-Pro-AMC pour une activité aminopeptidase). La difficulté est donc de choisir le substrat permettant de définir une activité enzymatique non spécifique. C’est une méthode utilisée par exemple pour les Sérine-protéases (Chymotrypsine, Trypsine, Elastase) et la détection d’activités aminopeptidases. Aspmoet al que. (2004) déclarent ce type de substrat n’est pas optimal pour toutes les préparations enzymatiques commerciales, et en particulier pour la Neutrase.  Un substrat protéique synthétique, l’Azocoll, peut aussi être utilisé. C’est une préparation majoritairement constituée de collagène (Kristinsson et Rasco, 2000a et b). C’est un test simple et donnant des résultats qualitativement similaires à la caséine (Ferreira et Hultin, 1994). Ces derniers ont également utilisé l’Azocoll pour déterminer les caractéristiques cinétiques de l’enzyme (pH et température optimum).  En conclusion, quelle que soit la méthode choisie, le principal est d’utiliser un substrat standard et de travailler dans les conditions optimales de pH et de température de l’enzyme étudiée. Ces conditions optimales doivent être identiques à celles utilisées par la suite pour le substrat d’intérêt, sans quoi il devient difficile de relier les informations obtenues ; c’est pourtant le problème majeur que l’on retrouve dans la littérature sur le sujet. Il est également important de bien établir comment est attribuée la correspondance activité protéolytique/quantité de composé libéré. Cependant, les méthodes utilisant les peptides p-Na ou les peptides-AMC permettent difficilement de déterminer l’activité protéolytique globale d’une enzyme. La méthode Azocoll est une méthode coûteuse, non reproductible selon les lots, encore peu développée et qui pose le problème de l’arrêt rapide de la réaction.La méthode utilisant comme substrat la caséine est la plus intéressante car moins contraignante que celle utilisant l’hémoglobine. C’est une méthode longue, un peu "laborieuse" mais fiable, et avec des protocoles bien définis.   II.5. Caractérisation de l’hydrolysat  Un hydrolysat enzymatique est décrit selon trois caractéristiques :  la source de protéines à l’origine de l’hydrolysat (substrat) fournit une information de base quant à la composition en acides aminés,  le degré d’hydrolyse (DH) est une valeur numérique (%) illustrant l’étendue de la coupure de la protéine générée par la réaction,  le profil de poids moléculaire (PM) quantifie la proportion (%) de peptides formés en fonction de leur taille.   II.5.1. Le degré d’hydrolyse   Différentes méthodes de mesure permettent de déterminer le degré d’hydrolyse des liaisons peptidiques. L troises différentes méthodes retrouvées dans la littérature sont, pour la plupart, basées sur principes différents :  §        la d’azotele dosa de méthode du K exem libéré la la cours de au
protéolyse et resté soluble en présence d’un agent précipitant, comme l’acide trichloracétique TCA (Sathivelet al., 2003),  §        par dosage spectrophotométrique parla détermination des groupement és libres l’acide trinitrobenzesulfonique TNBS (Adler-Nissen, 1986)ou par l’o-phtaldialdéhyde OPA (Nielsenet al., 2001),  §       sur le maintien d’un pH constant parla titration des protons libérés par la méthode du pH-stat, basée titration continue et automatique d’une base ou d’un acide. Dans cette méthode, le degré d’hydrolyse est déterminé par le nombre de liaisons peptidiques coupées(h)sur le nombre total de liaisons(htot) (Adler-Nissen, 1986).  aminé seraEn milieu basique, pour des pH compris entre 6 et 9.5, le groupe plus ou moins dissocié, libérant ainsi des ions H+qui seront neutralisés par les ions OH-provenant du pH-stat. Le coefficient de dissociation du groupe aminé va donc déterminer le facteur de correspondance entre le nombre de liaisons coupées et le nombre de moles de base utilisées pour maintenir le pH constant. Adler-Nissen, en 1986, a établi la formule suivante concernant le degré d’hydrolyse (DH) :   DH (%) = h = B.Nb x 100  htot Mp. htot.  Avec B : quantité de base consommée (en mL) pour maintenir le pH constant,  Nb M de la base,: normalitép: masse de protéines (en g),  htot total de liaisons peptidiques dans la protéine,: nombre  (10pH-pK) / (1 + 10pH-pK),    =  et pK = 7.8 + ((298 – T) / (298 × T)) × 2400, avec T = température en Kelvin.                                                                                                       Le dosage de la quantité d’azote libéré par la méthode de Kjeldahl est relativement fastidieux et nécessite d’importants volumes d’échantillon. Par ailleurs, celui-ci ne peut s’effectuer en continu lors du process d’hydrolyse. Cependant, cette méthode a été utilisée avec succès sur des protéines de poisson (Hoyle et Merritt, 1994 cités par Kristinsson et Rasco, 2000a) et sur d’autres protéines alimentaires où, pour l’hydrolyse de lactosérum par la trypsine, une bonne corrélation a été relatée avec la méthode du pH-stat (Margotet al., 1994, cités par Panyam et Kilara, 1996).  La méthode du pH-stat constitue la méthode de référence car elle est utilisée par de nombreux auteurs pour un contrôle en continu du degré d’hydrolyse sur des protéines alimentaires. C’est une méthode simple, rapide, reproductible et non dénaturante. En revanche, Silvestre (1997) relate que les valeurs de DH obtenues par cette méthode sont relatives et que leur exactitude doit être contrôlée par d’autres méthodes telles celles au TNBS ou à l’OPA.  La méthode au TNBS, développée par Adler-Nissen en 1979, est toujours utilisée pour déterminer le DH lors d’hydrolyses de protéines alimentaires. La méthode à l’OPA est cependant relatée comme étant plus facile à mettre en œuvre, plus rapide et plus sûre d’un point de vue environnemental. Elle est également plus sensible, même si l’OPA manque de réactivité avec la cystéine et ne réagit pas avec la proline (Silvestre, 1997).   II.5.2. La caractérisation des hydrolysats par chromatographie  De nombreuses études ont été réalisées sur la séparation des protéines ou peptides par des procédés chromatographiques.La chromatographie liquide d’exclusion de taille permet la caractérisation analytique de mélanges peptidiques suivant leur poids moléculaire, elle est également utilisée à l’échelle semi-préparative ou préparative.  Les types de gels commerciaux utilisés le plus souvent pour une séparation àbasse pressionsont les gels Sephadexâ (Desporteset al., 2000) et Bio-gelâ (Franeket al., 2000). fractionnement Leur domaine de dépend du type de gel et de leurs propriétés respectives, ils peuvent être utilisés dans la purification des