LA MOLECULE SC3, UNE NOUVELLE STRUCTURE DEFINIE A LA SURFACE DES LYMPHOCYTES B HUMAINS PAR UN ANTICORPS MONOCLONAL : EXPRESSION CELLULAIRE ET PROPRIETES FONCTIONNELLES.

Ingrid Dutot

Description

Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Ingrid DUTOT Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes LA MOLECULE SC3, UNE NOUVELLE STRUCTURE DEFINIE A LA SURFACE DES LYMPHOCYTES B HUMAINS PAR UN ANTICORPS MONOCLONAL : EXPRESSION CELLULAIRE ET PROPRIETES FONCTIONNELLES. Soutenu le 13 Février 2007 devant le jury suivant : Dr Ali Bettaieb - Président Pr Jean-Claude Gluckman - Rapporteur Dr Serge Jacquot - Examinateur Dr Odile Devergne – Examinateur Pr François Tron - Examinateur Laboratoire d'Immunologie Cellulaire et Immunopathologie de l'EPHE Directeur : Pr Jean-Claude Gluckman () Centre Hayem Hôpital St-Louis 1, rue Claude Vellefaux 75010 PARIS Laboratoire d'Immunopathologie Clinique et Expérimentale - Hôpital Charles Nicolle CHU de Rouen et INSERM U519 Faculté de Médecine et de Pharmacie Directeur : Pr François Tron Directeur du Stage: Dr Serge Jacquot () 22, Boulevard Gambetta 76183 ROUEN Cedex SC3, UNE NOUVELLE STRUCTURE DEFINIE A LA SURFACE DES LYMPHOCYTES B HUMAINS PAR UN ANTICORPS MONOCLONAL : EXPRESSION CELLULAIRE ET EPHE Banque de Monographies SVT 1

• reverse transcription- polymerase


• cellule


• défaut des voies induisant l'apoptose


• réaction de polymérisation en chaîne


• origine de la production des anticorps


• inverse


• production de cytokines inflammatoires

Sujets

• Nicolle

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• Publié par: profil-nechor-2012
• Publié le: 01 février 2007
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Extrait

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE     ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES   Sciences de la Vie et de la Terre   MEMOIRE Présenté par Ingrid DUTOT [e-mail]   Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes       LA MOLECULE SC3, UNE NOUVELLE STRUCTURE DEFINIE A LA SURFACE DES LYMPHOCYTES B HUMAINS PAR UN ANTICORPS MONOCLONAL : EXPRESSION CELLULAIRE ET PROPRIETES FONCTIONNELLES.       Soutenu le 13 Février 2007 devant le jury suivant :     Dr Ali Bettaieb - Président Pr Jean-Claude Gluckman - Rapporteur Dr Serge Jacquot - Examinateur Dr Odile Devergne – Examinateur Pr François Tron - Examinateur     Laboratoire d’Immunologie Cellulaire et Immunopathologie de l’EPHE Directeur : Pr Jean-Claude Gluckman ([e-mail]) Centre Hayem Hôpital St-Louis 1, rue Claude Vellefaux 75010 PARIS     Laboratoire d’Immunopathologie Clinique et Expérimentale - Hôpital Charles Nicolle CHU de Rouen et INSERM U519 Faculté de Médecine et de Pharmacie Directeur : Pr François Tron Directeur du Stage: Dr Serge Jacquot ([e-mail]) 22, Boulevard Gambetta 76183 ROUEN Cedex   SC3, UNE NOUVELLE STRUCTURE DEFINIE A LA SURFACE DES LYMPHOCYTES B HUMAINS PAR UN ANTICORPS MONOCLONAL : EXPRESSION CELLULAIRE ET

PROPRIETES FONCTIONNELLES.     Ingrid DUTOT     RESUME

    L’anticorps monoclonal SC3 a été produit par la technique des hybridomes après immunisation de souris BALB/c avec la lignée de cellules NK humaines YTindi. Notre objectif était de déterminer la distribution de la molécule SC3, l’effet de l’activation cellulaire sur son expression, et son rôle fonctionnel au cours de l’activation des lymphocytes B. L’étude de l’expression de la molécule reconnue par l’anticorps SC3 à la surface de différentes populations cellulaires hématopoïétiques a été réalisée par marquages multiples en cytométrie en flux. Les résultats montrent que l’anticorps monoclonal SC3 marque préférentiellement la population lymphocytaire B. L’expression de la molécule SC3 sur les lymphocytes B a été étudiée en cytométrie en flux après activations des lymphocytes B par différentes stimulations (SAC lysat de Staphylocoque Aureus Cowan I, anticorps anti-IgM, CD154 et IL-2). Nos résultats montrent que l’expression de la molécule SC3 augmente avec tous les types d’activation. L’expression est plus forte au 1 er jour puis commence à décliner à partir du 2 ème jour. Pour évaluer le rôle fonctionnel de la molécule SC3, nous avons testé l’effet de l’anticorps monoclonal SC3 sur la réponse proliférative des lymphocytes B activés. Nous avons montré tout d’abord que la présence de l’anticorps SC3 inhibe la prolifération des lymphocytes B activés par du SAC. En revanche, l’effet inhibiteur de l’anticorps monoclonal SC3 n’est pas retrouvé après activation des lymphocytes B par un anticorps anti-IgM associé ou non à des agonistes des TLR1, TLR2, TLR9, ou par la ligation de CD40 L’anticorps SC3 ne provoque pas l’apoptose des cellules. . Enfin, l’effet de l’anticorps SC3 sur la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes induite par le SAC ou le SAC associé à l’interaction avec CD70 a été évalué : le pourcentage de plasmocytes (cellules CD19 - /CD38 high ) contenus dans la culture augmente en présence de l’anticorps SC3, sans que ne varie l’expression des facteurs de transcription XBP1et PRDM1 intervenant dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes détectés par RT-PCR quantitative. L’identification par électrophorèse bi-dimentionnelle et spectrométrie de masse de la molécule SC3 est en cours au laboratoire, et sera la première étape pour poursuivre l’étude de SC3, une molécule qui régule la prolifération et la différenciation des lymphocytes B humains.     Mots clés :  Lymphocyte B, Marqueurs de différenciation cellulaire, Activation lymphocytaire B, récepteur inhibiteur.           TABLE DES MATIERES   RESUME     TABLE DES MATIERES  

  ABREVIATIONS     INTRODUCTION   1-   Le système immunitaire.   2-   Le lymphocyte B.   3-   Récepteurs inhibiteurs de la réponse des Ly B   4-   Les facteurs de transcription contrôlant la différenciation plasmocytaire.   5-   Objectif de l’étude : caractérisation de la molécule SC3.     BIBLIOGRAPHIE

ABREVIATIONS   Ac : Anticorps. Acm : Anticorps monoclonal. ADN : acide désoxyribonucléique. ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire. Ag : antigène. ARN : acide ribonucléique. ARNm : acide ribonucléique messager. BCR : récepteur des cellules B pour l’antigène. BCL-6 : “B-cell lymphoma 6”. BEt : Bromure d’éthidium. Blimp-1 :”B lymphocyte induced maturation protein 1“. BSA : “Bovine serum albumin” ou Albumine de sérum bovin. CD : “Cluster of differenciation” ou Classe de différenciation. CMH : Complexe majeur d’histocompatibilité. CMSP: “Cellule mononucléée du sang périphérique”. Cp : “Crossing point” ou point de croisement. Cpm : coups par minute. DICV : déficits immunitaires communs variables. ddNTP : didésoxyribonucléotide. dNTP : di-nucléotides tri-phosphate. DO : densité optique. ECD : “Energy Coupled Dye” ou “Phycoerythrine Texas Red”. EDTA : “Ethylene diamine tetra acetic acid” ou Acide éthylène diamine tetra acétique.

ELISA : ”Enzyme linked immuno sorbente assay“ ou Réaction immuno enzymatique. FITC : Isothiocyanate de Fluorescéine. GAPDH : “Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase”. HMBS : “Hydroxymethyl-bilane synthase”. Ig : Immunoglobuline. IL : Interleukine. ITIM : “Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif” ou Motif d’inhibition avec tyrosine des immunorécepteurs. KIR : “Killer cell immunoglobulin-like receptor” ou Récepteur des Ig des cellules tueuses. KO : “Knock out” ou inactivé. LB : Luria broth. LLC : Leucémie lymphoïde chronique. Ly B : Lymphocyte B. Ly T : Lymphocyte T. MALT : “Mucosae associated lymphoid tissue” ou Tissue lymphoïde associé au muqueuse. NK : “Natural killer” ou cellules tueuses naturelles. NLR : ”NOD-like receptor“ ou Récepteur de type NOD. Pax5 : “paired box gene 5”. PBS : “Phosphate Buffered Saline” ou Solution saline tamponnée en phosphate. PC5 : Phycoerythrin Cyanine 5. PCR : “polymerase chain reaction” ou Réaction polymérisation en chaîne. PE : Phycoerythrin. PRDM1 : “Positive regulatory domain 1”. PYR : Pyruvate. RE : Réticulum Endoplasmique. RLR : ” RIG-I-like receptor“ ou Récepteur de type RIG-I. RPL13A : “Ribosomal protein L13a”. RPM : “Round per minute” ou Tour par minute. RT-PCR : “Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction” ou Transcription inverse-Réaction polymérisation en chaine. SAC : Staphylococcus aureus cowan I. SVF : Sérum de veau foetal. TAE : Tris Acétate EDTA. TCR: Récepteur des cellules T pour l’antigène. TLR : “Toll-like receptor” ou Récepteur de type Toll. Tm : “Melting temperature” ou Température de fusion ou Température de demi dénaturation. TNF : “Tumor necrosis factor” ou Facteur nécrosant des tumeurs. T 3 H : Thymidine tritiée. UPR : “unfolded protein response” ou Réponse des protéines non pliées. XBP-1 : “X-box binding protein 1”.

INTRODUCTION     Les lymphocytes B (Ly B), à l’origine de la production des anticorps, sont un composant important de la réponse immunitaire adaptative (Shapiro-Shelef et al, 2005). Leur importance est démontrée par les manifestations pathologiques observées lors de leur perte de fonction, au cours des déficits de l’immunité humorale, comme les déficits immunitaires communs variables (DICV) qui sont caractérisés sur le plan clinique par la survenue d’infections bactériennes récurrentes et de différents types de cancers notamment des lymphomes B (Hammarstrom et al, 2000). A l’inverse, d’autres dysfonctionnements touchant les Ly B, notamment au niveau des mécanismes régulateurs de leur activation, de leur survie et de leur différenciation, peuvent conduire à la production d’auto- anticorps et à la survenue de maladies auto-immunes telles que le lupus érythémateux disséminé (Lipsky, 2001). En outre, le lupus et les maladies auto-immunes dans leur ensemble sont également associés à la survenue de lymphome B, conséquence probable de la stimulation antigénique persistante ou de défaut des voies induisant l’apoptose, qui constituent une prédisposition commune aux deux types de pathologies (Mackay et al, 2001).  Une meilleure connaissance des mécanismes régulant l’activation des Ly B apporterait un éclairage essentiel dans la compréhension de ces différentes pathologies.     1-      Le système immunitaire.    Le système immunitaire est un système complexe de défense de l’organisme contre les agressions infectieuses par les bactéries, les virus et les parasites. La défense de l’hôte contre une infection repose d'abord sur l’immunité innée. Il s’agit de la reconnaissance de l'agent infectieux soit par des effecteurs cellulaires préformés (phagocytes, lymphocytes “Natural Killer” (NK), cellules dendritiques) grâce à des récepteurs de l’immunité naturelle qui sont en nombre limité et par conséquent reconnaissent un nombre limité de structures biochimiques, soit par des molécules solubles comme les protéines de la voie alterne du complément. Les récepteurs de l’immunité naturelle, tels que les “Toll-like receptors” (TLR), exprimés par les cellules intervenant dans la réponse innée permettent la capture de l’antigène mais aussi le transfert de signaux d’activation dans la cellule. Trois familles similaires ont été identifiées : les TLR, NOD-like receptor (NLR) et RIG-I- like receptor (RLR) (Creagh EM et al, 2006). Les TLR reconnaissent les bactéries, les virus, les champignons et les protozoaires. Les NLR détectent les bactéries et les RLR reconnaissent les virus. Ces trois types de récepteurs organisent la réponse immunitaire innée. Des interactions entre les TLR et leurs ligands induisent l’activation de gènes de l’inflammation, laquelle conduit à la mise en place de mécanismes immunitaires, tels que par exemple la production de cytokines inflammatoires, afin d’éliminer l’agent pathogène (Creagh EM et al, 2006). Puis, après la réponse innée, une réponse adaptative est déclenchée. Grâce à la réponse immunitaire innée qui a mis en place une réponse

inflammatoire, les leucocytes sont recrutés sur le lieu de l’infection. Les TLR qui ont reconnu les agents pathogènes organisent la réponse immunitaire adaptative (Iwasaki et al, 2004).   Les cellules dendritiques activées lors de la réponse immunitaire innée vont permettre le transport d’antigènes (Ag) vers les organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate et formations lymphoïdes des muqueuses) puis vont avoir un rôle de cellules présentatrices d’Ag. La réponse immunitaire adaptative est ainsi contrôlée par la réponse immunitaire innée (Janeway, 1989). La reconnaissance des Ag par les Ly B et T naïfs va permettre leur prolifération et leur différenciation en cellules effectrices. Cette reconnaissance de l’antigène se fait grâce aux récepteurs de l’immunité adaptative que sont le récepteur des cellules B (BCR) et le récepteur des cellules T (TCR). Il existe une grande diversité de récepteurs permettant la reconnaissance d’un très grand nombre de motifs antigéniques. Ces récepteurs ne sont pas codés par des gènes en configuration germinale mais sont le fruit de réarrangements somatiques de segments de gènes. La réponse adaptative est exercée par les Ly B (réponse humorale avec production d’anticorps) et les Ly T (réponse cellulaire). Lors d’une ré- infection, il existe d’une part une immunité protectrice fondée sur la présence des Ac produits lors du premier contact avec l’Ag et, d’autre part, une mémoire immunologique mise en place lors de la primo-infection. Les Ly B et Ly T mémoires spécifiques reconnaissent l’agent infectieux et permettent ainsi une expansion et une différenciation rapide des cellules effectrices et l’élimination de l’agent infectieux.           2-      Le lymphocyte B.   Les Ly B sont produits dans la mœlle osseuse et acquièrent l’expression d’IgM et d’IgD membranaires. Les Ly B récemment émigrés de la mœlle, encore immatures et dits transitionnels sont identifiés par la forte expression de CD24 et CD38 (Carsetti et al, 2004). Ces cellules naïves migrent vers les organes lymphoïdes secondaires, précisément dans des follicules lymphoïdes, où elles se différencient, après activation, en cellules sécrétrices d’Ac appelées plasmocytes, ou en Ly B mémoires. Les Ly B ne représentent que 10% des lymphocytes totaux dans le sang.   L’activation du Ly B est dépendante de l’engagement de son BCR par un Ag. Cette interaction Ag-BCR induit des signaux intra-cellulaires. Il existe deux types d’activation des Ly B, l’activation T-dépendante et l’activation T-indépendante (Shapiro-Shelef et al, 2005).   Dans la réponse T dépendante, l’activation du Ly B nécessite une coopération avec des Ly T auxiliaires (Liu et al 1996). Quelques Ly B activés gagneront les follicules primaires pour donner naissance aux centres germinatifs. Le centre germinatif est le siège des évènements suivants :

ü       Prolifération ou expansion clonale.       Commutation de classe d’immunoglobulines (Ig). ü ü     Acquisition de mutations somatiques des gènes d’Ig.    ü Différenciation en Ly B mémoire.       ü       Différenciation en plasmocytes sécréteurs d’Ac. ü       Apoptose.

  Les Ly B activés se multiplient intensément dans la zone sombre du centre germinatif. Ces Ly B appelés alors centroblastes diminuent leurs Ig de surface et, en se divisant, accumulent de nombreuses mutations somatiques dans les gènes codant les domaines variables des chaînes lourdes et légères des Ig, augmentant ou diminuant ainsi l’affinité des Ig synthétisées pour l’Ag. Puis, les centroblastes se transforment en centrocytes en migrant dans la zone claire du centre germinatif. Les centrocytes ré-augmentent des Ig de surface. Ils se trouvent au contact d’un réseau dense de cellules dendritiques folliculaires présentant des Ag natifs à leur surface, induisant pour le centrocyte porteur d’un BCR spécifique un signal de survie, tandis que ceux ayant une affinité insuffisante pour l’Ag subissent une mort par apoptose. Le signal de survie dépend aussi d’une coopération spécifique avec le Ly T (Liu et al, 1996).   Les interactions complexes entre les cellules T et B sont médiées par des cytokines, protéines solubles de faible poids moléculaire régulant le système immunitaire dans son ensemble, et par des interactions récepteurs – ligands entre des molécules membranaires comme la famille des récepteurs du Tumor necrosis factor (TNF) (Smith et al, 1994). Cette famille inclut des récepteurs importants pour la régulation des Ly B tels que CD40 et CD27 (Watts, 2005). La molécule CD40 induit la prolifération des Ly B (Banchereau et al, 1991). Elle induit également la formation des Ly B des centres germinatifs et la différenciation en Ly B mémoires, et inhibe la différenciation des Ly B en plasmocytes (Arpin et al, 1995). La molécule CD27, en revanche, a un rôle capital pour le devenir des Ly B, puisqu’elle induit aussi bien la différenciation des Ly B en plasmocytes (Jacquot et al, 1997) que l’apoptose des Ly B activés (Prasad et al, 1997).     Quelques Ag cependant sont thymo-indépendants, c’est le cas des Ag à structure très répétitive comme les dextranes ou les protéines de la surface de certains virus qui dans la plupart des cas ne peuvent pas être présentés dans le contexte des molécules du CMH. La réponse immunitaire B T-indépendante est induite par un Ag à motif répétitif qui stimule fortement le BCR. Il a été montré qu’une molécule appartenant à la famille du TNF intervient dans cette réponse T-indépendante : il s’agit de la molécule CD257 (BAFF) qui est sécrétée par les cellules dendritiques (Cancro, 2001). BAFF est produit par les cellules d’origine myéloïde, et n’est pas exprimé par les Ly T. BAFF est essentiel au développement des Ly B matures périphériques. Il interagit avec trois récepteurs qui sont CD269 (BCMA), CD267 (TACI) et CD268 (BAFF-R), et qui appartiennent également à la famille des récepteurs du TNF (Vaux, 2002). BAFF agit spécifiquement sur les Ly B périphériques en

particulier sur les Ly B transitionnels et les Ly B de la zone marginale qui sont responsables de la réponse B thymo-indépendante (Defrance et al, 2002). Cependant, dans l’activation thym-o indépendante des Ly, d’autres facteurs que l’interaction CD40-CD154, sont susceptible d’induire une commutation isotypique.   Les TLR interviennent dans la réponse B T-dépendante et dans la réponse T-indépendante. Les TLR sont présents sur des leucocytes incluant les Ly B. Les TLR ne sont pas fortement exprimés sur les Ly B naïfs mais apparaissent en nombre plus important après une activation du BCR par un Ag. L’interaction d’agonistes avec les TLR amplifie l’activation B (Iwasaki et al, 2004). Il a été démontré que les TLR jouent un rôle important dans l’activation des Ly B et également dans leur différenciation en plasmocytes (Ruprecht et al, 2006). Les TLR intervenant dans l’activation des Ly B sont les TLR2, TLR6, TLR7, TLR9 et le TLR10 (Ruprecht et al, 2006). Les ligands sont pour le TLR2, les lipoprotéines bactériennes ou des acides lipoteichoiques, pour le TLR6, les lipoprotéines bactériennes, pour le TLR7, l’ARN viral simple brin, pour le TLR9, les motifs CpG de l’ADN non méthylé. Les ligands de TLR10 restent encore inconnus.     3-      Récepteurs inhibiteurs de la réponse des Ly B.   Une nouvelle catégorie de récepteurs transmettant un signal inhibiteur a récemment été identifiée. C’est le cas de CD152 (CTLA-4) sur le Ly T, CD72 et CD22 sur le Ly B, CD5 pour les Ly T et B, et CD33 sur les cellules myéloïdes (Ravetch et al, 2000).   Certains de ces récepteurs inhibiteurs sont exprimés par les Ly B. Parmi les récepteurs de la famille de CD28, qui sont pour la plupart des molécules de co-stimulation telles que CD28 et CD278 (ICOS), il existe un sous-groupe de récepteurs qui ont un effet inhibiteur. Ces récepteurs sont CD152 (CTLA-4) qui est exprimé sur les Ly T, et CD279 (PD-1) ainsi que CD272 (BTLA) qui sont exprimés sur les Ly T et les Ly B. Ces molécules ne sont pas exprimées de façon constitutive mais sont induites lors de l’activation de la cellule. Un motif protéique dans la région intracytoplasmique caractérise les récepteurs inhibiteurs, c’est le motif ITIM (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif). Le motif ITIM contient une tyrosine (Ile/Val/Leu/Ser)-X-Tyr-X-X-(Leu/Val) qui a un rôle important dans la fonction du récepteur où ce motif est présent (Sharpe et al, 2002). Des récepteurs activateurs, comme les complexes BCR-CD79a/CD79b ou TCR-CD3 possèdent au niveau des chaînes polypeptidiques CD79 ou CD3 des motifs protéiques ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) dans la région intracytoplasmique. Les motifs ITAM permettent de recruter lors de l’activation des tyrosine-kinase qui phosphorylent les tyrosines du motif ITIM. Quand le récepteur inhibiteur interagit avec son ligand, cela permet le recrutement d’enzymes intracellulaires qui sont soit des tyrosine-phosphatases (SHP1-SHP2) soit une inositol- phosphatase (SHIP). SHP1 ou SHP2 vont déphosphoryler les tyrosines et bloquer la mise en jeu des voies de signalisation activatrice des récepteurs comme le complexe TCR-CD3 ou BCR-CD79. Le

BCR, le TCR et la molécule CD28 activent la PI3-kinase qui phosphoryle des inositols, lipides de la membrane cellulaire. De ce fait, une cascade de signalisation est déclenchée, ce qui délivre un autre signal d’activation à la cellule. SHIP, qui est recruté lors de l’interaction de certains récepteurs inhibiteurs, va déphosphoryler les inositols et bloquer les voies d’activation de la cellule (Greenwald et al, 2005). Les ligands de PD-1 sont CD274 (PDL-1) et CD273 (PDL-2) qui sont apparentés à la famille de CD80, ligands de CD28. BTLA a comme ligand la molécule HVEM (Herpes virus entry mediator), qui est un récepteur de la famille des récepteurs du TNF. Il existe un autre récepteur inhibiteur, le récepteur CD32 (FcgRIIB). C’est un récepteur pour le fragment Fcg des Ig exprimé par les Ly B et qui induit une inhibition de leur activation. Ce récepteur contient aussi un motif ITIM (Daeron et al, 1995). Lorsque le BCR reconnaît un Ag présent sous la forme de complexe immun IgG/Ag, la partie Fc de l’IgG se fixe sur le récepteur FcgRIIB. Cette fixation induit le recrutement de SHIP qui va déphosphoryler les inositols et par conséquent entraîner l’arrêt de l’activation de la cellule (Mackay et al, 2006).    Les autres récepteurs inhibiteurs présents sur les Ly B sont CD22, CD5, CD72, CD66a, ILT, PIR-B et LAIR-1. Tous ces récepteurs possèdent un motif ITIM (Ravetch et al, 2000)  L’équilibre entre des signaux de stimulation et d’inhibition est nécessaire pour réguler la réponse immunitaire et le maintien de la tolérance. Un dérèglement des voies d’activation ou d’inhibition peut entraîner des maladies auto-immunes. Par exemple, un déficit fonctionnel du récepteur FcgRIIB peut être associé aux mécanismes pathologiques du lupus érythémateux disséminé (Mackay et al, 2006).     4-      Les facteurs de transcription contrôlant la différenciation plasmocytaire.   Le Ly B a pour rôle principal à terme la production d’Ac. Les plasmocytes, cellules productrices d’Ac, sont le stade terminal de différenciation des Ly B. Des mécanismes moléculaires contrôlant la différenciation des Ly B en plasmocytes ont été récemment identifiés. Les principaux travaux portent sur des modèles murins. Quelques facteurs de transcription semblent jouer un rôle majeur (Lin et al, 2003 ; Shapiro-Shelef et al, 2005).   XBP-1 (X box binding protein 1) permet la mise en place de la machinerie cellulaire nécessaire à la production d’Ig en grande quantité grâce à l’induction de la « unfolded protein response » (UPR) (Iwakoshi et al, 2003). L’UPR est un mécanisme ubiquitaire présent dans de nombreux types cellulaires (Brewer et al, 2005). Il protège la cellule contre le stress dû à l’engorgement du réticulum endoplasmique (RE) par des protéines mal repliées et permet au RE de s’adapter à la synthèse d’un grand nombre de molécules d’Ig fonctionnelles (Gass et al, 2004). XBP- 1 organise l’expansion des organelles intracellulaires (RE, Golgi, mitochondries, lysosomes). Il est important de souligner que les souris dont les lymphocytes sont privés d’XBP-1 sont incapables de

produire des Ig. XBP-1 intervient également dans la survie du plasmocyte. En effet, il a été montré que la production d’IL-6 est dépendante de XBP-1 et que cette cytokine joue un rôle dans le développement des plasmocytes et dans leur survie (Iwakoshi et al, 2003).   PRDM1 “Positive regulatory domain 1” (ou Blimp-1, “B lymphocyte induced maturation protein 1”) est le deuxième facteur de transcription important intervenant dans la différenciation en plasmocytes. En effet, PRDM1 est un répresseur de la transcription dont l’expression dans des Ly B murins activés induit leur différenciation en plasmocytes. Il éteint le programme d’expression des gènes caractéristiques de la prolifération et de la fonction des Ly B matures, c’est-à-dire signalisation par le BCR, présentation d’Ag, formation des centres germinatifs, commutation isotypique et hypermutation somatique (Cattoretti et al, 2005). PRDM1 exerce une large répression sur différents gènes, par exemple CD19, CD21 et CD22, dont l’expression à la surface du Ly B diminue (Lin et al, 2003 ; Calame, 2001). Il induit un petit nombre de gènes dont XBP-1 qui aide à la mise en place du programme de production et sécrétion des Ig (Shapiro-Shelef et al, 2005 ; Shaffer et al, 2002). PRDM1 bloque l’expression de deux facteurs de transcription BCL-6 (B-cell lymphoma 6 protein) et Pax5 (Paired box protein 5). Lors d’une forte activation par le BCR, ceci va provoquer la dégradation de BCL-6 et par conséquent libérer PRDM1 (Tunyaplin et al, 2004). Du fait que PRDM1 bloque Pax5, ceci entraîne la libération de l’expression de XBP-1 et aussi celle des chaînes J, IgH et IgL (Shapiro-Shelef et al, 2005). Ainsi, la différenciation des Ly B en plasmocytes est contrôlée par deux facteurs de transcription : PRDM1 et XBP-1 (Shaffer et al, 2004). XBP-1 ne peut conduire seul la différenciation en plasmocytes, PRDM1 étant également nécessaire. En l’absence de l’un de ces deux facteurs de transcription, la différenciation en plasmocytes ne s’enclenche pas (Shaffer et al, 2004 ; Lin et al, 2003). Les cytokines ont également un rôle important dans le développement des plasmocytes. Les cytokines IL-10 et IL-21, associées à d’autres médiateurs, induisent fortement l’expression de PRDM1 (Shapiro-Shelef et al, 2005). Il a été mis en évidence que PRDM1 est aussi nécessaire pour la survie des plasmocytes (Jonhson et al, 2005). Enfin l’expression de PRDM1 est quasiment absente dans les lignées B néoplasiques (Cattoretti et al, 2005).   Les gènes pax5 (Paired box protein 5) et bcl-6 (B-cell lymphoma 6 protein) sont exprimés par les Ly B des centres germinatifs et ont un rôle inhibiteur de la différenciation en plasmocytes (Lin et al, 2003).   Pax5 est caractéristique des Ly B. Il est exprimé dès le stade pro-B et son expression est augmentée par l’activation de la voie CD40. Pax5 régule un ensemble de gènes qui maintient l’identité du Ly B, par exemple CD19, et régule négativement les gènes associés à la sécrétion d’Ig par les plasmocytes. Il inhibe donc la différenciation des Ly B en plasmocytes (Lin et al, 2003). L’induction de XBP-1 par PRDM1 se fait par l’intermédiaire d’une répression de Pax5 par PRDM1. Pax5 est l’inhibiteur de XBP-1 et la levée de cette inhibition par PRDM1 permet une augmentation significative de l’expression de XBP-1 dans la cellule. Cependant, la seule levée de l’inhibition de

Pax5 ne permet pas d’atteindre le niveau d’expression de XBP-1 observé dans les plasmocytes. D’autres mécanismes inducteurs de l’expression complète de XBP-1 restent à identifier (Lin et al, 2003 ; Nera et al, 2006).   BCL-6 est fortement exprimé dans les Ly B des centres germinatifs (Allman et al, 1996). BCL-6 inhibe les inhibiteurs des kinases cycline-dépendantes, p27 et p21, ce qui provoque une prolifération rapide des cellules. Il a été démontré que BCL-6 contrôle directement l’expression de CD80, qui est une molécule intervenant dans l’interaction entre les Ly B et T. Cette interaction est un des éléments conduisant au développement d’une réponse immunitaire humorale avec production d’Ac (Niu et al, 2003). Une des cibles de BCL-6 est PRDM1 : BCL-6 réprime la différenciation en plasmocytes et l’expression de PRDM1 (Lin et al, 2003). De plus, on remarque que PRDM1 réprime BCL-6, lui-même inhibiteur de la transcription de PRDM1 (Tunyaplin et al, 2004). Cette boucle de rétrocontrôle négatif une fois mise en jeu assure l’engagement définitif du Ly B dans la voie de différenciation plasmocytaire.     5-      Objectif de l’étude : caractérisation de la molécule SC3.    L’anticorps monoclonal (Acm) SC3 a été obtenu par le docteur Armand Bensussan (Unité 659 de l’INSERM à Créteil) après l’immunisation de souris BALB/c avec la lignée de cellules NK humaines, YTindi, avec l’objectif de mettre en évidence de nouvelles molécules à la surface des cellules humaines NK. Il s’agit d’un Ac de classe IgM et par convention, nous appellerons « molécule SC3 » la cible reconnue par l’Ac SC3.   Nikolova et al, 2005 ; Vidal-Laliena et al, 2005 ont montré que l’Acm SC3 marque certes la lignée NK YTindi, mais préférentiellement la population lymphocytaire B humaine, et semble spécifique d’une structure jusqu’ici non identifiée. L’Ac reconnaît une protéine de 95-100 kDa comme l’ont montré des expériences d’immunoempreintes de cellules de la lignée NK YTindi. Le thème de recherche spécifique de notre équipe étant le Ly B, l’unité d’Armand Bensussan nous a confié cet Ac pour caractériser la molécule SC3 et étudier les propriétés fonctionnelles de l’Acm SC3.   Nous avons donc précisé l’expression et le rôle de SC3 dans la régulation de la fonction des Ly B en étudiant sa distribution au sein des populations hématopoïétiques, en observant les effets de l’activation des Ly B sur son expression, puis en examinant les conséquences de la présence dans le milieu de culture de l’Acm SC3 sur la prolifération des Ly B et leur différenciation en plasmocytes.