MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Section des Sciences de la Vie et de la Terre Mémoire présenté par Anne LAMBERT Pour l’obtention du Diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes Expression des récepteurs des cytokines et de leurs régulateurs négatifs : modèles de l’hormone de croissance, de la prolactine, de l’interféron gamma et des protéines inhibitrices de leur signalisation Soutenu le 13 Décembre 2001 devant le jury composé de M. Xavier Ronot - Président M. Jean-Marie Exbrayat - Rapporteur M. Gérard Morel - Examinateur M. Lucien Frappart - Examinateur M. Hichem C. Mertani - Examinateur M. François Veillet - Examinateur Laboratoire de Reproduction et Développement des Vertébrés Ecole Pratique des Hautes Etudes Directeur : Pr. J.M. Exbrayat (jmexbrayat@univ-catholyon.fr) Travail effectué dans le laboratoire CNRS UMR 5123 - Université Claude Bernard-Lyon I Directeur du laboratoire : Pr. H. Barré
LAMBERT Anne Date de soutenance : le 13 Décembre 2001
Directeur de recherche : Dr. G. Morel (gerard.morel@univ-lyon1.fr) Expression des récepteurs des cytokines et de leurs régulateurs négatifs : modèles de l’hormone de croissance, de la prolactine, de l’interféron gamma et des protéines inhibitrices de leur signalisation RESUME L’hormone de croissance humaine (hGH) et la prolactine humaine (hPRL) ont des effets métaboliques et mitogènes sur les cancers et les cirrhoses hépatiques ainsi que sur les cancers de la glande mammaire humaine. Ces hormones agissent sur leurs cellules-cibles par l’intermédiaire de récepteur membranaire spécifique. L’étude quantitative par hybridationin situ l’expression des de récepteurs de la hGH et de la hPRL, respectivement, hGHR et hPRLR, et la localisation de leur protéine par immunocytologie en microscopie photonique montrent une augmentation de l’expression des gènes codant pour le hGHR et le hPRLR dans les hépatocarcinomes humains et les cancers de la glande mammaire humaine selon leur propre grade d’évolutivité. En revanche, dans les cas de cirrhose, seule l’expression du hPRLR est augmentée par rapport aux tissus normaux. Cette augmentation des récepteurs confirme le rôle hyperprolifératif de la GH et de la PRL dans les pathologies cancéreuses étudiées. La liaison de ces cytokines/hormones à leur récepteur déclenche le mécanisme de transduction du signal utilisant principalement la voie des JAK/STAT. Or, les protéines CIS/SOCS, en inhibant la phosphorylation des facteurs de transcription JAK et STAT, bloquentla transduction du signal et interviennent ainsi dans la régulation négative des effets de ces cytokines/hormones. L’étude par hybridationin situ, suivie d’une quantification, des ARNm codant pour les protéines CIS/SOCS montre une augmentation nette de leur expression dans les cancers mammaires humains comparée à celle du tissu sain. Ces résultats suggèrent une intervention des protéines CIS/SOCS comme facteur limitant l’activation déclenchée par les cytokines/hormones, s’opposant ainsi au développement tumoral. Enfin, la localisation de l’IFNg endogène et de son récepteur (sous unités a et b) dans le foie normal de souris par immunocytologie ultrastructurale nous a permis de déterminer leur distribution dans les divers compartiments cellulaires (membrane plasmique, réticulum endoplasmique, mitochondrie et noyau). L’injectionin vivo de l’IFNg, comme exemple de cytokine, et le suivi de son internalisation confirment leur trafic intracellulaire. Mots-clés :GH, PRL, interféron, récepteurs des cytokines, CIS/SOCS, homme, souris, cancers de la glande mammaire, hépatocarcinomes, hybridationin situ, immunocytologie, microscopie photonique, microscopie électronique
SOMMAIRE
INTRODUCTION ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE I. LES RECEPTEURS DES CYTOKINES I.1. Caractéristiques I.1.1. Une nouvelle famille de récepteurs I.1.2. Structure I.2. Le récepteur de l’hormone de croissance (GHR) I.2.1. Gène du GHR I.2.2. Expression des ARNm du gène du hGHR I.2.3. Structure de la protéine du hG HR I.2.4. Localisation des ARNm codant pour le hG R H I.2.5. Variation de l’expression de l’ARNm codant pour le hGHR I.2.6. Synthèse et renouvellement I.3. Le récepteur de la prolactine (PRLR) I.3.1. Gène du hPRLR I.3.2. Expression des ARNm I.3.3. Structure des protéines du hPRLR I.3.4. Localisation des ARNm et des protéines du hPRLR I.3.5. Variation de l expression des ARNm et de la protéine du hPRLR ’ I.3.6. Synthèse et renouvellement I.4. Les récepteurs de l’interféron gamma (IFNgR) I.4.1. Gènes de l’IFNg R I.4.2. Expression des ARNm I.4.3. Structure des protéines de l’IFNgR I.4.4. Localisation du hIFNgR I.4.5. Synthèse et renouvellement II. LES LIGANDS II.1. Généralités sur les cytokines II.1.1. Historique II.1.2. Structure II.1.3. Comparaison Cytokines/Hormones II.1.4. Mode d’action des cytokines II.2. L’hormone de croissance (GH) II.2.1. Historique II.2.2. Structure du gène codant pour la GH II.2.3. Structure de la hGH II.2.3.1. Structure primaire II.2.3.2. Structure secondaire et tertiaire II.2.4. Sécrétion de la hGH II.2.4.1. Production de hGH
1 3 3 3 3 4 4 4 5 6 6 7 7 7 8 8 9 10 11 12 12 13 13 15 15 16 16 16 17 17 17 18 18 18 19 19 19 20 20
II.2.4.2. Régulation de la sécrétion de la GH II.2.5. Effets de la GH II.2.6. Dégradation de la GH II.2.7. Pathologies associées à la hGH II.3. La prolactine (PRL) II.3.1. Historique II.3.2. Structure du gène codant pour la hPRL II.3.3. Structure de la hPRL II.3.3.1. Structure primaire de la hPRL II.3.3.2. Structure secondaire et tertiaire de la hPRL II.3.4. Synthèse de la PRL II.3.4.1. Production de PRL II.3.4.2. Régulation de la sécrétion de PRL II.3.5. Effets de la PRL II.3.6. Pathologies associées à la PRL II.4. L’interféron gamma (IFNg) II.4.1. Historique II.4.2. Structure du gène codant pour l’IFNg II.4.3. Structure de l’IFNg II.4.4. Sécrétion d’IFNg II.4.4.1. Production d’IFNg II.4.4.2. Régulation de la synthèse d’IFNg II.4.5. Effets de l’IFNg II.4.6. Dégradation de l’IFNg II.4.7. Pathologies associées à l’IFNg III. LA TRANSDUCTION DU SIGNAL ; LA VOIE JAK/STAT III.1. Généralités sur les voies d’activation JAK/STAT III.1.1. Les protéines JAK III.1.2. Les protéines STAT III.1.3. La transduction du signal III.2. Voies de transduction du signal pour la hGH, la hPRL et le MuIFNg III.2.1. La hGH III.2.2. La hPRL III.2.3. Le MuIFNg IV. REGULATION NEGATIVE DU SIGNAL DES CYTOKINES IV.1. storique Hi IV.2. Les différentes voies de la régulation négative des cytokines IV.3. Les protéines CIS et SOCS IV.3.1. Historique IV.3.2. Les protéines CIS IV.3.2.1. Gènes des protéines CIS IV.3.2.2. Structure des protéines CIS IV.3.2.3. Localisation des ARNm codant pour les protéines CIS IV.3.2.4. Mode d’action de la protéine CIS IV.3.3. Les facteurs SOCS IV.3.3.1. Gènes des protéines SOCS
21 21 22 22 23 23 23 23 23 24 24 24 25 26 27 28 28 28 28 29 29 29 30 30 30 31 31 31 32 32 33 33 33 34 34 34 34 35 35 36 36 36 36 37 37 37
IV.3.3.2. Structure des protéines des SOCS IV.3.3.3. Localisation des ARNm codant pour les protéines SOCS IV.3.3.4. Activation des protéines SOCS IV.3.4. Régulation de l’expression des protéines de la famille CIS MATERIELS ET METHODES I. INTRODUCTION II. MATERIELS II.1. Les pathologies hépatiques II.1.1. La cirrhose II.1.2 L'hépatocarcinome II.2. Les pathologies mammaires II.2.1. Le fibroadénome II.2.2. Le cancer mammaire canalaire III. LES DIFFERENTES TECHNIQUES UTILISEES III.1. Mise en évidence du hGHR, du hPRLR et des protéines de la famille des CIS III.1.1. Immunocytologie indirecte en microscopie photonique III.1.1.1. Principe III.1.1.2. Tissus III.1.1.3. Anticorps utilisés III.1.1.4. Immunocytologie indirecte en microscopie photonique III.1.1.5. Contrôles de la réaction III.1.2. Hybridation in situ en microscopie photonique III.1.2.1. Principe III.1.2.2. Tissus III.1.2.3. Choix des sondes III.1.2.4. Marquage des sondes III.1.2.5. Prétraitements III.1.2.6. Paramètres de l’hybridation III.1.2.7. Hybridationin situ III.1.2.8. Lavages III.1.2.9. Révélations autoradiographiques III.1.2.10. Semi-quantification du signal macro-autoradiographique III.1.2.11. Contrôles III.2. Mise en évidence de l’interféron g (INFg) et de ses récepteurs (IFNgRa et IFNgRb) III.2.1. Principe III.2.2. Animaux et tissus III.2.3. Anticorps III.2.4. Réaction immunocytologique indirecte en microscopie électronique III.2.5. Observations III.2.6. Quantification du signal III.2.7. Contrôles de la réaction RESULTATS I. EXPRESSION DES RECEPTEURS DE LA GH ET DE LA PRL DANS LE FOIE
37 38 39 40 41 41 42 42 42 42 42 42 43 43 43 43 44 44 45 45 46 46 47 47 48 50 51 52 53 53 55 55 56 56 57 57 58 58 59 59 60
HUMAIN NORMAL ET PATHOLOGIQUE I.1. Localisation des protéines du hGHR et du hPRLR I.2. Localisation des ARNm codant pour le hGHR et le hPRLR I.2.1 Analyse macro-autoradiographique I.2.2. Analyse micro-autoradiographique II. EXRESSION DES RECEPTEURS DE LA GH ET DE LA PRL DANS LA GLANDE MAMMAIRE NORMALE ET TUMORALE II.1. Localisation des protéines du hGHR et du hPRLR II.2. Localisation des ARNm codant pour le hGHR et le hPRLR II.2.1. Analyse macro-autoradiographique, localisation et quantification II.2.2. Analyse micro-autoradiographique III. EXPRESSION DES GENES DE LA FAMILLE DES PROTEINES SOCS/CIS DANS LA GLANDE MAMMAIRE NORMALE ET TUMORALE III.1. Analyse macro-autoradiographique, localisation et quantification III.2. Analyse micro-autoradiographique IV. EXPRESSION DE L’IFNg ET DES SOUS-UNITESa ETb SON DE RECEPTEUR DANS LE FOIE DE SOURIS TRAITEE OU NON PAR L’IFNg IV.1. Localisation ultrastructurale de l’IFNg IV.2. Localisation ultrastructurale de la sous-unité a du récepteur de l’IFNg IV.3. Localisation ultrastructurale de la sous-unité b du récepteur de l’IFNg DISCUSSION REGULATION DES RECEPTEURS DE LA GH ET DE LA PRL DANS LES PATHOLOGIES HEPATIQUES HUMAINES REGULATION DES RECEPTEURS DE LA GH ET DE LA PRL DANS LES PATHOLOGIES MAMMAIRES HUMAINES REGULATION DES PROTEINES CIS ET SOCS DANS LES PATHOLOGIES MAMMAIRES HUMAINES INTERNALISATION DU COMPLEXE FORME ENTRE L’IFNg ET SON RECEPTEUR CONCLUSION ET PERSPECTIVES REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ABREVIATIONS A : Adénine Aa : Acides aminés Ac : Anticorps ADN : Acide désoxyribonucléique ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire Ag : Antigène ARN : Acide ribonucléique ARNm : Acide ribonucléique messager
60 60 61 62 63 63 63 64 65 66 66 68 69 69 70 71 72 74 76
78
82 84
ARNt : Acide ribonucléique de transfert C : Cytosine CIS : “Cytokine Inhibiting Signaling DAB : 3,3’diaminodenzindine-tetrahydrochloride dpm : Désintégration par minute DTT : Dithiothréïtol G : Guanidine GAR : Sérum “Goat anti-rabbit GH : Hormone de croissance (“Growth Hormone) hGH : Hormone de croissance humaine (“Human Growth Hormone) hGHR : Récepteur de l’hormone de croissance humaine (“Human Growth Hormone Receptor) HIS : Hybridationin situ hPRL : Prolactine humaine hPRLR : Récepteur de la prolactine humaine IFNg : Interféron gamma IFNgR : Récepteur de l’interféron gamma IFNgRa : Récepteur de l’interféron gamma sous-unité a IFNgRb : Récepteur de l’interféron gamma sous-unité b JAB : “JAK-binding protein MeV : Mega ElectronVolt pb : Paire de bases PBS : “Phosphate buffer saline PLP : Paraformaldéhyde-lysine-périodate PRL : Prolactine SOCS : “Suppressor Of Cytokine Signaling SSC : “Standart sodium citrate SS : “STAT-induced STAT inhibitor I T : Tymidine Tm : Température de fusion (“Melting temperature) U : Uracile dATP-a[35S] : Désoxy adénosine triphosphate soufre 35
INTRODUCTION Dès la mise en évidence de l’hormone de croissance humaine (hGH pour “human Growth Hormone) par Li et Papkoff en 1956 et de la prolactine humaine (hPRL) par Shome et Parlow en 1977, de nombreuses études ont été réalisées pour déterminer leur rôle dans différentes pathologies humaines. Il a ainsi été démontré que la hGH et la hPRL ont des actions métaboliques et mitogénes, en particulier dans différentes pathologies humaines. Par exemple, la hGH et la hPRL exercent un effet stimulateur de la prolifération des cellules tumorales de la glande mammaire et du foie. Elles agissent par liaison à un récepteur spécifique localisé sur la membrane cellulaire. Le récepteur de la hGH, ou hGHR, et le récepteur de la hPRL, ou hPRLR, font partie de la superfamille des récepteurs des cytokines. Leur structure se caractérise par la présence d’un seul domaine transmembranaire, d’un domaine extracellulaire et d’un domaine intracellulaire contenant la boîte 1 (Kelly et coll., 1991, 1993 ; O’Neil et Yu-Lee, 1993). Le hGHR a été cloné par Leung et coll., en 1987. Des études réalisées dans notre laboratoire ont montré la présence de ce récepteur dans de nombreux tissus humains (comme le rein, le muscle et
l’épiderme). Leur présence a également été décrite dans des tissus pathologiques, comme les cancers de la glande mammaire ou les hépatocarcinomes (Levinowitz et coll., 1990 ; Decouvelaere et coll., 1995). Le hPRLR a été cloné en 1989 par Boutin et coll., et récemment, une nouvelle isoforme intermédiaire du récepteur, a été mise en évidence et caractérisée (Clevenger et coll., 1995 ; Kline et coll., 1999). Ces deux formes de récepteurs ont été localisées sur de nombreux types cellulaires notamment dans la glande mammaire normale et tumorale. Ces deux hormones sont désormais considérées comme de véritables cytokines (Waters et coll., 1999). L’interféron gamma (IFNg), une autre cytokine, exerce un rôle immunomodulateur très important dans la réponse immunitaire aux infections de type virales et bactériennes. Il ralentit la prolifération tumorale. Son récepteur, ou IFNgR, joue un rôle majeur dans la différenciation des cellules hématopoïétiques (Miyajima et coll., 1992). Il est constitué de deux sous-unités a et b. C’est un récepteur ubiquitaire, non exprimé par les érythrocytes (Van Loon et coll., 1991). Les effets de l’IFNg pourraient être conditionnés par son adressage subcellulaire, comme cela est décrit dans de nombreux cas de facteurs de croissance et d’hormones. Cependant très peu de travaux décrivent les mécanismes d’internalisation et de redistribution intracellulaire de l’IFNg et de son récepteur. Les hGHR, hPRLR et l’IFNgR activent les différentes voies de transduction du signal. La voie principale est celle des “Janus Kinase/Signal Transducers and Activators of Transcription (JAK/STAT). Le mécanisme d’action de cette voie est bien défini, il débute par la dimérisation ou l’oligomérisation du récepteur lors de la liaison du ligand à son récepteur. Les complexes formés (ligand-récepteurs) vont induire l’autophosphorylation de la protéine JAK associée physiquement à la boite 1 du récepteur. L’activation des protéines JAK induit alors la phosphorylation du domaine intracellulaire du récepteur, générant ainsi des sites d’ancrage pour les facteurs de transcription STAT. Les facteurs STAT phosphorylés par les protéines JAK se dimérisent, sont importés dans le noyau, où ils se fixent sur des séquences promotrices des gènes et activent leur transcription (Ihle et coll., 1996 ; Darnel., 1997 ; Sadir, 1999). Cependant, l’action des cytokines est limitée en amplitude et durée par des mécanismes de régulations négatives médiés par les protéines “Suppressor Of Cytokine Signaling/Cytokine Inhibiting Signaling (SOCS/CIS) (Yoshimura et coll., 1995). Ces protéines, qui sont à l’heure actuelle au nombre de 7, sont activées par des cytokines précises. Ces protéines inhibent la phosphorylation des facteurs de transcription JAK et STAT et bloquent la transduction du signal. Elles interviennent ainsi dans la régulation négative des effets de ces cytokines/hormones. Le rôle de ces protéines dans les cancers humains est peu étudié mais certains travauxin vitrosuggèrent qu’elles seraient inhibées lors des phases de prolifération cellulaire (Nagai et coll., 2001 ; Yoshikawa et coll., 2001). Les objectifs de ce mémoire, après une revue bibliographique présentant les caractéristiques du hGHR, du hPRLR, du IFNgR et de leur ligand respectif ainsi que des protéines CIS et SOCS, sont de montrer par une étude quantitative, l’importance de l’expression de ces récepteurs dans différents types de cancers pour définir leur régulation et leur rôle dans les phénomènes d’hyperprolifération tumorale.
I LES RECEPTEURS DES CYTOKINES I.1. Caractéristiques I.1.1. Une nouvelle famille de récepteurs La superfamille des récepteurs des cytokines joue un rôle majeur dans la prolifération et la différenciation cellulaire (Miyajima et coll., 1992). Elle comprend une vingtaine de récepteurs différents, et se trouve divisée en deux classes : - la classe I contient des protéines sous la forme d’homo/hétérodimères. Dans cette classe, la fixation du ligand au domaine extracellulaire apparaît suffisante pour l’induction de la dimérisation de 2 chaînes polypeptidiques identiques. Cette classe regroupe non seulement le GHR, le PRLR mais aussi les récepteurs de l’érythropoïétine (EPO), de la thrombopoïétine, du GM-CSF, des interleukines (Il) telles que : Il-2 à Il-7, Il-9, Il-11, Il-12, Il-15 (Bazan, 1989 ; Cosman, 1993 ; Kitamura et coll., 1994). Elle regroupe également des sous-unités de récepteurs tels que la sous-unité a du récepteur de l’Il-12 ou la chaîne b du récepteur de l’Il-3 (O’Shea et coll., 1997). - la classe II regroupe notamment les récepteurs des interférons (IFNR) a, b, g et l’Il-10 (Sprang et Bazan, 1993). I.1.2. Structure sont des glycoprotéines caractérisées par :Ces récepteurs Øun seul domaine transmembranaire (Kelly et coll., 1993) ; Øun domaine extracellulaire localisé dans la portion N-terminale de la protéine et comportant des homologies de séquences (de 15 à 35 %) dont deux paires de résidus de cystéines (Kelly et coll., 1993) et un motif conservé Trp-Ser-x-Trp-Ser (WSxWS) [x est un acide aminé quelconque (dans la région juxta-membranaire)], ce motif bien que n’étant pas en contact avec le ligand interviendrait dans l’affinité de la liaison (Kelly et coll., 1991 ; 1993) ; Øappelées boîtes 1 et 2 (“box1 etun domaine intracellulaire possédant 2 régions conservées “box2) (Cosman, 1993) localisé dans la portion C-terminale de la protéine. Le motif “box1 contient une séquence caractéristique riche en résidus de proline, est impliqué dans la liaison directe avec les protéines tyrosine kinases spécifiques, les protéines JAK (O’Neil et Yu-Lee, 1993). Le motif “box2 est caractérisé par une séquence de résidus hydrophobes suivie d’un ou deux résidus chargés. I.2. Le récepteur de l’hormone de croissance (GHR) I.2.1. Gène du GHR L’ADNc codant pour le GHR hépatique humain a été cloné en 1987 (Leung et coll., 1987) à partir de fragments d’ADNc du GHR de lapin. La structure complète du gène du GHR humain (hGHR) a été déterminée par Godowski et coll. à partir d’une banque d’ADN génomique.en 1989 Ce gène de 87 kb est localisé sur le bras court du chromosome 5 dans la région p13.1®p12 (Barton et coll., 1989). Il est présent en un seul exemplaire par génome haploïde et présente des similitudes avec celui du PRLR (Arden et coll., 1990). Il possède 9 exons numérotés de 2 à 10. L’exon 2 code pour le peptide signal, les exons 3 à 7 pour le domaine extracellulaire, l’exon 8 pour le
domaine transmembranaire et les exons 9 et 10 pour le domaine intracellulaire (Godowski et coll., 1989). Le gène du GHR hépatique a aussi été cloné dans d’autres espèces, notamment chez le rat (Baumbach et coll., 1989 ; Mathews et coll., 1989), et la souris (Smith et coll., 1989). I.2.2. Expression des ARN du gène du hGHR m Un seul transcrit de 4,7 kb codant pour le hGHR a été mis en évidence par Leung et coll. en 1987. En 1992, l’équipe de Urbanek, caractérisant alors le hGHR placentaire à partir d’une banque d’ADNc placentaire humain, a montré l’existence d’un second transcrit par la technique de “Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) liquide. Ce nouveau transcrit se caractérise par une délétion de 66 pb dans l’exon 3. Le hGHR délété de l’exon 3 lie la hGH de 22 kDa et les autres membres de la famille GH/PRL avec une moins grande affinité (Sobrier et coll., 1993 ; Urbanek et coll., 1993). Les régions 5’ régulatrices non traduites ou 5’-UTR (“UnTranslated Region) sont très hétérogènes entre les espèces, ce qui suggère que leur expression est sous le contrôle d’un promoteur différent selon les tissus. La présence de multiples 5’UTR mRNA variants a été montré. Ces “ variants incluent la région 5’-UTR et le promoteur du gène (Pekhletsky et coll., 1992). Dans le foie humain 8 variants différents (V1 à V8) ont été identifiés. En 1997, Zou et coll. ont montré par “Northern blot, l’expression exclusive du variant V1 dans le foie adulte humain sans aucune autre expression dans les tissus de l’organisme. I.2.3. Structure de la protéine du hGHR Le GHR des protéines de masse molaire comprise entre 60 et 110 kDa (Hughesregroupe et coll., des1985). Il a été montré la présence d’autres GHR minoritaires qui pourraient être soit formes différentes du GHR soit des formes dégradées (Carter Su et coll., 1983 ; Asakawa et coll., 1986 ; Husman et coll., et coll., 130 kDa (Leung1988). La masse molaire du GHR glycosylé est de 1987 ; Spencer et coll., 1988 ; 1990). L’équipe de Fuh et coll. (1990) a montré, qu’après clonage du domaine extracellulaire du hGHR de foie dans un plasmide deEscherichia coli, le domaine extracellulaire non-glycosylé du hGHR possède quasiment les mêmes propriétés de fixation que le domaine extracellulaire glycosylé isolé à partir de sérum humain. Ces résultats suggèrent donc que la glycosylation n’est pas indispensable pour la fixation de la hGH à son récepteur. Le GHR a été purifié dans le foie humain en 1990 (Hocquette et coll., 1990). Il en existe 2 formes : - une protéine mature de 70 kDa composée de 620 acides aminés (aa) formant une chaîne protéique unique avec un peptide signal de 18 aa. Le récepteur est constitué : Ød’un domaine extracellulaire de 246 aa comportant 5 sites potentiels de N-glycosylation et 7 résidus de cystéine (Leung et coll., 1987) dont 6 forment trois ponts disulfures (Fuh et coll., 1990), un tryptophane et un motif Tyr-Gly-Glu-Phe-Ser proche du domaine transmembranaire (motif WSxWS), Ød’un domaine transmembranaire hydrophobe de 24 aa entre les aa 247 et 270, Ø domaine d’un cystéine impliqué dans la deintracellulaire de 350 aa constitué de 9 résidus transduction du signal. - une protéine de liaison à la GH circulante la “GH-Binding Protein (GHBP) qui correspond au domaine extracellulaire du GHR constitué des aa 238 à 246 (Leung et coll., 1987). Sa synthèse est obtenue, chez l’homme et le lapin, par clivage protéolytique d’un site du GHR proche de la membrane (Leung et coll., 1987), chez les rongeurs, par épissage alternatif du pré-messager du GHR (Baumbach et coll., 1989 ; Smith et coll., 1989). La GHBP est une glycoprotéine soluble de 51 kDa chez l’homme (Hocquette et coll., 1990). Elle a pour rôle le transport de la GH jusqu’aux cellules-cibles, la ré du taux de GH circulant, l’au de la demi-vie de la GH en diminuant
son élimination rénale. Elle assure également la disponibilité de la GH pour les cellules-cibles (Baumann et coll., 1987, 1994 ; Cramer et coll., 1992 ; Wells, 1994). Des techniques d’immunocytologie ont montré une localisation nucléaire du GHR (Waters et coll., 1990, 1993). En microscopie électronique le GHR a été visualisé sur la membrane nucléaire interne et externe, l’hétérochromatine et le nucléole. Ce GHR nucléaire possède la même antigénicité et la même masse molaire que le GHR (Lobie et coll., 1991). I.2.4. Localisation des ARNm codant pour le hGHR La localisation de l’expression du gène du hGHR a é é étudiée dans de nombreux tissus t humains normaux et pathologiques. L’expression de l’ARNm codant pour le hGHR de 4,7 kb a été localisée, par les techniques d’hybridationin situet d’immunocytochimie, dans le pancréas, l’œsophage, l’estomac, l’intestin grêle et le colon (Delehaye-Zervas et coll., 1994). Une forte expression des ARNm codant pour le GHR a été mise en évidence dans le rein, le muscle et l’épiderme, alors qu’une faible expression a été observée dans le cœur, le thymus, la glande mammaire, l’ovaire, le testicule et l’hypoderme (Mertani et coll., 1995). L’ARNm a aussi été visualisé dans l’hypophyse humaine (dans les cellules somatotropes, lactotropes et gonadotropes) (Mertani et coll., 1995). Dans les tissus normaux, le hGHR délété de l’exon 3 s’exprime d’une manière ubiquitaire non restreintes aux villosités placentaires (Sobrier et coll., 1993 ; Mercado et coll., 1994). Dans des situations pathologiques telles que : - les hépatocarcinomes, Levinowitz et coll. (1990) ont montré par la technique de “Northern blot que chez le rat, la quantité d’ARNm codant pour le GHR chute de 30 à 50 % dans les nodules et de 90 à 95 % dans les tumeurs issues de ces nodules. Le niveau d’expression du gène du GHR pourrait donc être un marqueur de la différenciation cellulaire hépatique. Chez l’homme, l’expression du gène codant pour le GHR est détectée dans des lignées d’hépatomes (Urbanek et coll., 1993). En 1990, l’équipe de Chang et coll. a montréin vivo du hGHR dans les l’absence hépatocarcinomes et les cirrhoses du foie par la technique de liaisonin vitro. En revanche, par la technique de “Sourthern blot et de RT-PCR liquide, l’équipe de Esposito et coll., (1994) a détecté la présence d’ARNm du hGHR. - dans les cancers de la glande mammaire, deux formes de hGHR ont été mises en évidence par la technique de RT-PCR liquide suggérant un rôle pour la GH dans ces cancers (Decouvelaere et coll., 1995). - dans les cancers de la prostate, l’équipe de Utergasser et coll. (1999) a montré que la GH hypophysaire serait impliquée dans la prolifération de tumeurs bénignes et /ou malignes en agissant directement sur la prostateviason récepteur. I.2.5. Variation de l’expression de l’ARNm codant pour le hGHR L’expression du gène du GHR varie au cours du développement fœtal. Cependant, une étude récente a montré qu’il n’existe pas de modification du niveau d’expression du gène codant pour le GHR dans les cellules périphériques du sang telles que les lymphocytes T, les lymphocytes B et les monocytes au cours du vieillissement chez des individus âgés de 12 à 64 ans (Bresson et coll., 1999). I.2.6. Synthèse et renouvellement Le GHR est synthétisé dans le réticulum endoplasmique, glycosylé dans l’appareil de Golgi puis inséré dans la membrane plasmique. Sa biosynthèse est très rapide. Ainsi dans des
