MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE

Bernard Lacour

Description

Niveau: Supérieur
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE MEMOIRE Présenté par Guiti THEVENOT Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes TITRE : Transfert de gènes dans des cellules épithéliales des voies aériennes humaines à l'aide de deux types de vecteurs non viraux : polymères glycosylés et vecteurs bactériens. Application à la mucoviscidose. Soutenu le 23 juin 2004 Devant le jury suivant : M. Bernard LACOUR Président Mme. Sylvie DEMIGNOT Rapporteur Mme. Armelle LETURQUE Examinateur Mme. Noufissa OUDRHIRI Examinateur Mme. Isabelle FAJAC Examinateur Laboratoire de PHARMACOLOGIE CELLULAIRE Directeur : Professeur Jean CHAMBAZ () Laboratoire de PHYSIOLOGIE RESPIRATOIRE Faculté de Médecine Cochin Port-Royal Directeur : Docteur Isabelle FAJAC () ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE TRANSFERT DE GÈNES DANS DES CELLULES ÉPITHÉLIALES DES VOIES AÉRIENNES HUMAINES À L'AIDE DE DEUX TYPES DE VECTEURS NON VIRAUX: POLYMÈRES GLYCOSYLÉS ET VECTEURS BACTÉRIENS. APPLICATION À LA EPHE Banque de Monographies SVT 1

• trafic intracellulaire des complexes plasmide


• culture primaire……………………………………


• cellules épithéliales des voies aériennes


• outgrowths des explants de muqueuse bronchique


• efficacité du transfert de gènes


• expression des gènes rapporteurs

Sujets

• Lacour

Informations

• Publié par: chaeh
• Publié le: 01 juin 2004
• Nombre de lectures: 43
• Langue: Français

Extrait

MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE

ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE

MEMOIRE

Présenté par
Guiti THEVENOT


Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes

TITRE :
Transfert de gènes dans des cellules épithéliales des voies aériennes humaines à l'aide de deux
types de vecteurs non viraux : polymères glycosylés et vecteurs bactériens. Application à la
mucoviscidose.


Soutenu le 23 juin 2004


Devant le jury suivant :

M. Bernard LACOUR Président
Mme. Sylvie DEMIGNOT Rapporteur
Mme. Armelle LETURQUE Examinateur
Mme. Noufissa OUDRHIRI
Mme. Isabelle FAJAC


Laboratoire de PHARMACOLOGIE CELLULAIRE
Directeur : Professeur Jean CHAMBAZ ([e-mail])

Laboratoire de PHYSIOLOGIE RESPIRATOIRE
Faculté de Médecine Cochin Port-Royal
Directeur : Docteur Isabelle FAJAC ([e-mail])

ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE


TRANSFERT DE GÈNES DANS DES CELLULES ÉPITHÉLIALES DES VOIES
AÉRIENNES HUMAINES À L'AIDE DE DEUX TYPES DE VECTEURS NON VIRAUX:
POLYMÈRES GLYCOSYLÉS ET VECTEURS BACTÉRIENS. APPLICATION À LA
EPHE Banque de Monographies SVT 1MUCOVISCIDOSE.

PRESENTE PAR
GUITI THEVENOT
2004
RESUME

La mucoviscidose est une maladie monogénique, autosomique et récessive sévère dont le
pronostic vital est lié à l'atteinte respiratoire. Elle n'est traitée actuellement que de façon
symptomatique et pourrait bénéficier d'un traitement par thérapie génique.

Mon travail a consisté à étudier deux types de vecteurs non viraux, des polycations
glycosylés et des vecteurs bactériens dérivés d'E.coli pour le transfert de gènes dans des cellules
épithéliales des voies aériennes, selon le degré de différenciation cellulaire. Des complexes
plasmide/polylysine glycosylée ou polyéthylèneimine (PEI) glycosylée ont été incubés en présence
des cellules glandulaires séreuses immortalisées CF-KM4 différenciées ou peu différenciées et
l'efficacité du transfert de gènes a été mesurée 48 h après. L'efficacité du transfert de gènes a été
également étudiée dans des cellules bronchiques humaines cultivées selon le modèle de l'explant.
L'efficacité du transfert de gènes à l’aide des polylysines glycosylées et dans une moindre mesure
avec les PEI glycosylées était fortement diminuée dans les cellules différenciées immortalisées ou
en culture primaire. Nous avons ensuite étudié l'entrée des complexes dans les cellules en
utilisant des complexes fluorescéinylés. Lorsque les cellules exprimaient les récepteurs
reconnaissant les résidus osidiques, l'entrée des complexes était similaire dans les cellules
différenciées ou peu différenciées. L’ensemble de ces résultats suggère que l’étape d’entrée dans
la cellule ne suffit pas à déterminer l’efficacité du transfert de gènes, mais que le trafic
intracellulaire qui suit l’endocytose joue un rôle déterminant.

Le trafic intracellulaire des complexes plasmide/PEI lactosylée a été étudié en culture
primaire dans les cellules épithéliales des voies aériennes à l'aide de complexes marqués
analysés en microscopie confocale après marquage des organites intracellulaires. Nos résultats
ont montré qu'une des étapes limitant l'efficacité du transfert de gènes est la faible entrée des
complexes dans le noyau.

Une étude similaire a été réalisée avec les vecteurs bactériens. Leur faible efficacité de
transfert dans les cellules épithéliales des voies aériennes semble liée à un trafic intracellulaire
inefficace du plasmide vers le noyau, une fois qu'il a été libéré de la bactérie lysée dans les
lysosomes.

L'ensemble de nos résultats suggère que pour améliorer l'efficacité du transfert de gènes, il
est nécessaire de favoriser le trafic du plasmide vers le noyau. La substitution du plasmide lui-
même par des résidus osidiques reconnus par des lectines favorisant le passage dans le noyau
est à l'étude.


MOTS CLES

Transfert de gènes - Mucoviscidose - Vecteurs chimiques - vecteurs bactériens - Cellules
épithéliales des voies aériennes
SOMMAIRE

I : INTRODUCTION
…………………………………………………………………………….12
EPHE Banque de Monographies SVT 2
1. LA MUCOVISCIDOSE………………………………………………………………………14
1. 1. Description clinique et traitement actuel………………………………………………..14
1. 2. Le gène CFTR et la protéine CFTR……………………………………………………..15

2. THERAPIE GENIQUE ET MUCOVISCIDOSE……………………………………………
17
2. 1. Thérapie génique…………………………………………………………………………..17
2. 1. 1. Principe.………………………………………………………………………………….17
2. 1. 2. Les vecteurs utilisés en thérapie génique……………………………………………17

2. 2. Application à la mucoviscidose…………………………………………………………...18
2. 2. 1. Généralités.………………………………………………………………………………18

2. 2. 2. Vecteurs lipidiques………………………………………………………………………20
- Structure…………………………………………………………………………………………20
- Efficacité de transfert de gènes dans la mucoviscidose……………………………………21
- Trafic intracellulaire des lipoplexes…………………………………………………………...21

2. 2. 3. Les polymères cationiques : La polylysine……………………………………………22
- Structure…………………………………………………………………………………………22
- Efficacité de transfert de gènes à l’aide de polylysines glycosylées……………………...23
- Trafic intracellulaire de complexes plasmide/polylysine glycosylée……………………....23

2. 2. 4. Les polymères cationiques : La polyéthylèneimine…………………………………..25
- Structure…………………………………………………………………………………………25
- Efficacité de transfert de gènes
……………………………………………………………....25
- Trafic intracellulaire des complexes plasmide/PEI………………………………………….26




2. 2. 5. Vecteurs bactériens…………………………………………………………………….27
- Structure………………………………………………………………………………………..27
- Efficacité de transfert de gènes
……………………………………………………………...27
- Trafic intracellulaire……………………………………………………………………………28

II : BUT DE L’ETUDE……………………………………………………………………………
30
EPHE Banque de Monographies SVT 3
III : MATERIEL ET
METHODES……………………………………………………………….32

1. CULTURE DES CELLULES…………………………………………………………………
32
1. 1. Cellules épithéliales immortalisées des voies aériennes humaines…………………..32
1. 1. 1. glandulaires séreuses immortalisées : cellules CF-KM4………………….32
1. 1. 2. Cellules immortalisées de l’épithélium de surface des voies aériennes : cellules
∑CFTE29o-……………………………………………………………………………………….32

1. 2. Cellules épithéliales des voies aériennes humaines en culture primaire…………….33
1. 2. 1. Culture d'explant d'épithélium bronchique humain et étude de la différenciation
cellulaire des « outgrowths »…………………………………………………………………....33
1. 2. 2. Culture de cellules dissociées d'épithélium bronchique humain…………………...34

2. TRANSFERT DE GÈNES À L'AIDE DE POLYMÈRES
GLYCOSYLÉS……………….34
2.1. Polymères glycosylés…………………………………………………………...………….34
2. 1. 1. Polylysines glycosylées…………………………………………………………………34
2. 1. 2. Polyéthyléneimines glycosylées……………………………………………………….35

2. 2. Plasmides……………………………………………………………………………………35
2. 3. Formation des complexes plasmide/polymère glycosylé………………………………35
2. 4. Expression des gènes rapporteurs.………………………………………………………36

2. 5. Expression des lectines membranaires et entrée des complexes plasmide/
polymère glycosylé dans les cellules épithéliales des voies aériennes…………………….37
2. 5. 1. Néoglycoprotéines fluorescentes………………………………………………………37
2. 5. 2. Entrée des complexes plasmide/polymère glycosylé………………………………..37

2. 6. Trafic intracellulaire des complexes plasmide/polymère glycosylé…………………..38

3. TRANSFERT DE GENES A L'AIDE DE VECTEURS
BACTERIENS………………….39
3. 1. Vecteurs bactériens………………………………………………………………………..39
3. 2. Transfection à l'aide des vecteurs bactéri