MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'EDUCATION NATIONALE
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Frédéric DELBOS pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DU MECANISME DE L'HYPERMUTATION SOMATIQUE DES GENES V D'IMMUNOGLOBULINES : 1.Implication du processus de transcription de l'ADN. 2.Rôle des composants du système de réparation post- réplicatif des mésappariements. Soutenu le 25 juin 2003 devant le jury composé de : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN - Président Dr. Bruno CANQUE - Rapporteur Dr. Laurent FERRADINI - Examinateur Dr. Claude-Agnès REYNAUD - Examinateur Laboratoire de : Immunologie cellulaire et immunopathologie Directeur : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN l'E.P.H.E. INSERM EMI-13, Centre Hayem, Hôpital St Louis 1, avenue Claude Vellefaux - 75020 PARIS Laboratoire de : Développement du système immunitaire Directeur : Dr. Claude-Agnès REYNAUD Recherche Unité INSERM 373, Faculté de médecine Necker 156, rue de Vaugirard - PARIS cedex 15 ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre ETUDE DU MECANISME DE L'HYPERMUTATION SOMATIQUE DES GENES V D'IMMUNOGLOBULINES DELBOS Frédéric EPHE Banque de Monographies SVT 1
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- mémoire
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Frédéric DELBOS pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DU MECANISME DE L'HYPERMUTATION SOMATIQUE DES GENES V D'IMMUNOGLOBULINES : 1.Implication du processus de transcription de l'ADN. 2.Rôle des composants du système de réparation post- réplicatif des mésappariements. Soutenu le 25 juin 2003 devant le jury composé de : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN - Président Dr. Bruno CANQUE - Rapporteur Dr. Laurent FERRADINI - Examinateur Dr. Claude-Agnès REYNAUD - Examinateur Laboratoire de : Immunologie cellulaire et immunopathologie Directeur : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN l'E.P.H.E. INSERM EMI-13, Centre Hayem, Hôpital St Louis 1, avenue Claude Vellefaux - 75020 PARIS Laboratoire de : Développement du système immunitaire Directeur : Dr. Claude-Agnès REYNAUD Recherche Unité INSERM 373, Faculté de médecine Necker 156, rue de Vaugirard - PARIS cedex 15 ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre ETUDE DU MECANISME DE L'HYPERMUTATION SOMATIQUE DES GENES V D'IMMUNOGLOBULINES DELBOS Frédéric EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE présenté par Frédéric DELBOS pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DU MECANISME DE L’HYPERMUTATION SOMATIQUE DES GENES V D’IMMUNOGLOBULINES : 1.Implication du processus de transcription de l’ADN. 2.Rôle des composants du système de réparation post- réplicatif des mésappariements. Soutenu le 25 juin 2003 devant le jury composé de : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN - Président Dr. Bruno CANQUE - Rapporteur Dr. Laurent FERRADINI Examinateur - Dr. Claude-Agnès REYNAUD - Examinateur Laboratoire de : Immunologie cellulaire et immunopathologie Directeur : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN l’E.P.H.E. INSERM EMI-13, Centre Hayem, Hôpital St Louis 1, avenue Claude Vellefaux - 75020 PARIS Laboratoire de : Développement du système immunitaire Directeur : Dr. Claude-Agnès REYNAUD Recherche Unité INSERM 373, Faculté de médecine Necker 156, rue de Vaugirard - PARIS cedex 15 ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre ETUDE DU MECANISME DE L’HYPERMUTATION SOMATIQUE DES GENES V D’IMMUNOGLOBULINES DELBOS Frédéric
25 juin 2003 RESUME L’hypermutation somatique des gènes V d’immunoglobulines est un processus adaptatif unique en biologie, permettant d’accumuler jusqu’à 10-3 mutations/paire de base/division cellulaire. Nous avons tenté de préciser le mécanisme moléculaire de ce processus encore mal connu, par deux approches différentes. La première concerne la corrélation entre transcription et hypermutation, la seconde l’implication des systèmes de réparation post-réplicatif des mésappariements dans le processus d’hypermutation. Plusieurs arguments expérimentaux suggèrent une corrélation entre la transcription d’un gène d’immunoglobuline et son taux de mutation. Nous avons donc voulu tester l’implication de l’ARN polymérase II dans l’introduction des mutations somatiques. Nous avons introduit une séquence de terminaison de la transcription (constituée d’un signal de polyadénylation et d’une séquence de pause pour l’ARN polymérase II) au sein d’un transgène de chaîne légère d’immunoglobuline. Ce substrat a été intégré en tandem avec un transgène contrôle, sans signal d’arrêt de la transcription. Les transgènes présentant le signal de terminaison de la transcription montrent un taux de mutation normal ou légèrement inférieur aux transgènes contrôles adjacents, alors que l’élongation de la transcription est réduite d’un facteur 50 à 100 sur les transgènes présentant le signal d’arrêt par rapport aux transgènes contrôles. Nous proposons donc que l’élongation de la transcription ne soit pas nécessaire à l’introduction des mutations somatiques, mais que ce soit le remodelage de la chromatine, par les facteurs de transcription, qui permette l’accessibilité du locus aux facteurs du processus d’hypermutation. Les nombreuses études de souris déficientes pour le système de réparation post-réplicatif des mésappariements de l’ADN ont montré que le complexe protéique MSH2/MSH6 semble jouer un rôle spécifique dans le processus de mutation somatique. Nous avons donc essayé de préciser quel rôle ce complexe pouvait avoir dans l’hypermutation en tentant d’exprimer, par transgénèse dans la lignée lymphoïde, une protéine MSH2 mutante. La mutation effectuée, décrite chez la levure, est susceptible d’entraîner la dissociation entre la fonction de réparation du complexe et son rôle hypothétique dans le processus d’hypermutation. L’impossibilité d’obtenir l’expression d’une protéine MSH2 mutante, en dépit de l’expression de son ARNm, ne nous a pas permis de préciser l’implication du complexe MSH2/MSH6 dans le processus d’hypermutation. Cependant, le faible niveau d’expression d’une protéine MSH2 restaurée, au sein de souris contrôles, est associé à un profil de mutation compris entre celui de souris sauvages et celui de sourisMsh2-/-Ce résultat semble donc confirmer un rôle. actif du complexe MSH2/MSH6 dans le processus d’hypermutation. Mots clés: gènes V d’immunoglobulines, hypermutation somatique, élongation de la transcription, système de réparation des mésappariements. SOMMAIRE Problématique p.1 Sommairep.3 Abréviations p.7 Introduction p.8
I) Répertoire B, généralités p.9 II) Maturation de l’affinité (réponse T-dépendante chez la souris et l’homme) p.15 1) Les organes lymphoïdes secondaires p.15 2) La réaction extrafolliculaire p.16 3) Le centre germinatif p.18 4) La commutation isotypique p.21 5) Signaux de la maturation de l’affinité p.22 III) Les mutations somatiques p.26 1) Outils d’étude des mutations somatiques p.26 A/ Cellules où le processus est actif p.26 a- Modèle murin b- Chez l’homme c- Modèle de mutations somatiquesin vitro B/ Quelles sont les séquences étudiées ? p.31 a- Séquences endogènes, transgènes, knock-in b Séquences mobilisées ou passagères - c- Analyse des mutations 2) Caractéristiques des mutations somatiques p.35 A/ Fréquence et répartition des mutations p.35 a- Fréquence b- Ciblage du gène V réarrangé c- Répartition des mutations B/ Nature des mutations p.38 a- La mutagénèse n’est pas aléatoire b- Biais des mutations somatiques pour certains motifs c- Cas particuliers des lignées BL2 et Ramos 3) Eléments établis de l’hypermutation somatique p.43 A/ Eléments nécessaires en cis p.43 a- Le promoteur b- Nécessité du gène V ? c- Les enhancers, éléments indispensables d- Implication de la transcription B/ Mécanismes moléculaires des mutations somatiques p.50 a- Système de réparation des mésappariements b- Coupures double-brins de l’ADN c- Quelle(s) sont les polymérase(s) candidates de l’hypermutation d- L’enzyme de maturation d’affinité, l’AID e- Un rôle pour une uracile-glycosylase ?
ABREVATIONS
ADN :acide désoxyribonucléique ADNc :acide désoxyribonucléique complémentaire AID :activation-induced cytidine deaminase APC :antigen presentating cell ARN :acide ribonucléique ARNm: ARN messager BCR :B cell receptor BER :base excision repair CDR :complementary determining region CMH :complexe majeur d’histocompatibilité CTD :carboxy-terminal transferase DC :dendritic cell FDC :follicular dendritic cell FR :framework region GFP :green fluorescent protein HEV :high endothelial venule HIGM :hyper IgM HNPCC :hereditary nonpolyposis colon cancer Ig :immunoglobuline INF :interféron LPS :lipopolysaccharide MAR :matrix attachement region MMR :mismatch repair NER :nucleotide excision repair NK :natural killer
NRO :nuclear run-on PALS :periarteriolar lymphoid sheath pb :paire de base PCR :polymerase chain reaction PNA :peanut agglutinin RPA :RNase protection assay TBM :tingible body macrophage TdT :terminal deoxynucleotidyl transferase TNF :tumor necrosis factor XP-V :xeroderma pigmentosum variant
INTRODUCTION
I) Répertoire B, généralités : Comment le système immunitaire peut-il protéger de manière efficace et spécifique contre des agents pathogènes aussi variés que les virus, les bactéries ou les parasites? On distingue généralement deux mécanismes de l'immunité, la réponse innée et la réponse adaptative. L'immunité innée désigne les mécanismes de défense comprenant à la fois les barrières physico-chimiques de l'organisme et les éléments capables d'agir dès les premières heures de l'infection: neutrophiles, monocytes et macrophages, qui détruisent les agents pathogènes par ingestion ou neutralisation grâce à des substances chimiques (cytokines, radicaux oxygénés). Les lymphocytes NK permettent également de lutter contre des pathogènes intracellulaires par l'action de cytokines comme l'INFg et le TNFa. L'immunité adaptative consiste généralement en une collaboration entre lymphocytes T, lymphocytes B et cellules dendritiques. Elle est plus longue à se mettre en place mais elle est spécifique d'un antigène donné et conduit à la formation d'une mémoire immunitaire. La réaction des cellules à mémoire fournira ensuite une réponse plus rapide et plus intense. La réponse adaptative est initiée par la reconnaissance de motifs structuraux de l'antigène, appelés épitopes. Lorsqu'une macromolécule ou une entité infectieuse pénètre dans l'organisme, deux types de reconnaissances spécifiques peuvent intervenir. En général, les épitopes accessibles à la surface de la molécule sont reconnus par les anticorps tandis que d'autres épitopes seront révélés par la capture puis l'apprêtement de l'antigène par des cellules spécialisées dans la présentation de l'antigène (APC). Les peptides apprêtés sont présentés à la surface cellulaire, au sein du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Au cours de la réponse adaptative, les lymphocytes B ont deux fonctions essentielles: -la possibilité après activation par un antigène de se transformer en plasmocytes, cellules sécrétrices d'anticorps (ou immunoglobulines). -la capacité à se comporter en APC, fonction indispensable pour leur collaboration
avec les lymphocytes T. Nous allons voir l’importance des immunoglobulines, molécules sièges de la diversité immunitaire, dans ces deux fonctions. Le problème de la génération de la diversité de cette réponse immunitaire se pose puisque le système immunitaire doit lutter contre des agents divers et en évolution constante. La variété des antigènes étant théoriquement illimitée, comment le génome d'un individu peut-il engendrer toute la gamme de molécules nécessaires à la reconnaissance spécifique de chacun des antigènes? Chez la souris et l'homme les lymphocytes B naissent de cellules souches hématopoïétiques, d'abord dans le foie fœtal puis dans la moëlle osseuse. Chez l'homme, la moëlle osseuse produit chaque jour environ 109chacun d'entre eux peut-il porter un récepteur B. Comment lymphocytes différent et unique? Chaque lymphocyte B néoformé présente à sa surface une immunoglobuline faite de la combinaison d'une chaîne lourde H (H pour "heavy") et d'une chaîne légère L (L pour "light"). Chacune de ces chaînes comporte à l'extrémité N-terminale les domaines variables VHDHJH (pour chaîne H) et VLJL(pour chaîne L) chargés de la reconnaissance de l'épitope, tandis que la partie C-terminale des chaînes H est un domaine constant, support des fonctions effectrices de ces molécules. Le réarrangement, premier élément de diversité des immunoglobulines, consiste en une association aléatoire entre les différentes régions du génome codant pour la partie variable: -pour les chaînes lourdes, un gène DH être rapproché d'un va J gèneH et l'ensemble DJ se rapproche ensuite d'un gène VH pour former le complexe VDJ (figure 1). Ce rapprochement est possible grâce à la présence de séquences signal de recombinaison (RSS) constituées de séquences palindromiques de 7 et 9 paires de bases séparées par des espaceurs de 12 ou 23 paires de bases (figure 2), ainsi qu'à l'expression de protéines permettant la recombinaison : RAG-1, RAG-2 et DNA-PK qui sont spécifiques du processus, et l’ADN ligase IV, XRCC4 et Artemis qui sont des molécules accessoires ubiquitaires. -pour les chaînes légères le scénario est identique mais seul existe ici un rapprochement VJ. Un lymphocyte B ne peut exprimer qu'une seule spécificité de reconnaissance (132). En effet, le phénomène de l'exclusion allélique, au sein de la moëlle osseuse, ne permet l'assemblage fonctionnel des chaînes légères et lourdes que sur un seul des deux allèles. Une diversité supplémentaire va être apportée par le mécanisme du réarrangement lui-même puisque les coupures peuvent engendrer l'adjonction de un ou plusieurs nucléotides palindromiques (diversité P) (90; 106), une activité exonucléase semble importante au niveau des jonctions de la chaîne lourde, et enfin la terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) va pouvoir, essentiellement pour les chaînes lourdes, ajouter quelques nucléotides au hasard aux jonctions V-D-J (diversité N) (2;13) (figure 3). De plus, notre équipe a pu montrer, chez la souris, un rôle de la polymérase mu (pol m dans les réarrangements des chaînes légères : elle semble en effet avoir une capacité de protection
des extrémités de l’ADN engendrées par les coupures, lors des jonctions V-J, (Bertocci et al ., soumis). réarrangement et diversité jonctionnelle, va doncCette double variabilité, combinatoire du permettre de générer un répertoire B pré-immun très vaste, de l'ordre de 1011spécificités différentes. Cependant cette diversité des cellules B naïves peut-elle être suffisante et permettre la reconnaissance d'un épitope unique avec une bonne affinité? Dans les années 1950-1960, le développement de méthodes précises de mesure des constantes d'affinité permet la démonstration de l'augmentation de l'affinité d'un anticorps spécifique au cours des immunisations successives. On donne à ce processus le nom de maturation d'affinité. En 1970, Weigert et Cohn montrent, à partir de myélomes murins, une variabilité des séquences protéiques de la chaîne légère d'immunoglobuline Vl et déduisent que les mutations somatiques sont à l'origine de ce phénomène (184). L'existence de mutations ponctuelles des acides nucléiques au niveau des gènes V, en réponse à une stimulation antigénique, est ensuite clairement prouvée par plusieurs équipes au début des années 80 grâce au séquençage des gènes d’immunoglobulines (22; 53; 80; 156). L’étude des mécanismes de la diversité du répertoire lymphocytaire a permis de mieux caractériser les acteurs responsables du réarrangement des gènes V, mais les mécanismes moléculaires des mutations somatiques restent assez mal connus. Chez l’homme, comme chez la souris, les mutations somatiques permettent la diversification des immunoglobulines lors de la réponse immunitaire à la suite d’une stimulation antigénique, afin d’augmenter l’efficacité de la réponse. Il a été également montré que chez le mouton les mutations somatiques ont lieu lors de la construction du répertoire primaire, en dehors de toute stimulation antigénique (146). Le processus de mutation somatique contribue donc à la diversification du répertoire B lors de réponses immunitaires chez la plupart des espèces, mais également à la mise en place du répertoire pré-immun chez certaines autres.
II) Maturation de l’affinité (réponse T-dépendante chez la souris et l’homme): deuxAu cours des années 1980, à partir de modèles murins, il a été établi que dans les semaines suivant l’immunisation, les processus de mutation somatique et de maturation d’affinité présentent des cinétiques parallèles. Les immunoglobulines sériques initiales de faible affinité ne sont pas mutées (15). L’augmentation de l’affinité des anticorps au fur et à mesure de l’évolution de la réponse immunitaire est corrélée avec l’augmentation du taux de mutation des gènes V des immunoglobulines. Cependant quels mécanismes permettent la maturation de l’affinité et les mutations somatiques, comment se fait la sélection des immunoglobulines de haute affinité ? Que deviennent les immunoglobulines de faible affinité ou reconnaissant les molécules du soi ?
1) Les organes lymphoïdes secondaires : Lors de la réponse adaptative, la probabilité qu’une cellule B et une cellule T, spécifiques d’un antigène protéique donné, se rencontrent après avoir été relarguées dans le système circulatoire du sang et de la lymphe par les organes lymphoïdes primaires, est très improbable. Pourtant leur collaboration étroite, impliquant un contact physique, est indispensable à l’initiation de la réponse immunitaire. L’organisme possède donc des structures organisées, les tissus lymphoïdes périphériques ou secondaires, permettant les interactions cellulaires nécessaires à la réponse immune. L’expression de molécules chimiotactiles et de récepteurs spécifiques (de la famille des chémokines) par les cellules amenées à se rencontrer, conjuguée à l’organisation anatomique spécifique des organes lymphoïdes secondaires est à la base de cette rencontre improbable (revues 30; 108). Ces organes facilitent donc la rencontre entre l’antigène et les cellules immunitaires, et constituent le lieu de l’amplification de la réponse et de la mémoire immunitaire. Les tissus lymphoïdes périphériques ont trois types de localisation, associées à leur rôle spécifique dans la réponse immune: les ganglions lymphatiques filtrent les éléments étrangers du liquide interstitiel, la rate remplit cette même fonction pour le sang, tandis que les organes lymphoïdes associés aux muqueuses forment une barrière efficace contre les antigènes exogènes qui abondent dans ces zones (ces derniers représentent 50% de la totalité des tissus lymphoïdes). Les organes lymphoïdes secondaires, à l’image d’un ganglion lymphatique, présentent une organisation caractéristique (figure 4). Outre l’important drainage sanguin et lymphatique, les cellules B et T se trouvent préférentiellement localisées dans des compartiments spécifiques: la zone B est constituée par les follicules et la zone T correspond aux gaines périartériolaires de la rate (PALS) ou des ganglions lymphatiques et des plaques de Peyer, à proximité des hautes veinules endothéliales (HEV). Des structures caractéristiques apparaissent au sein des organes lymphoïdes secondaires lors d’une réponse immunitaire T-dépendante contre un antigène: les centres germinatifs. 2) La réaction extrafolliculaire : aux organesLa première étape de la réaction adaptative est l’acheminement des antigènes lymphoïdes secondaires par les cellules dendritiques (ou DC pour « Dendritic-Cell »). Ces cellules sont localisées dans les tissus (35) (par exemple les cellules de Langherans de la peau) et sont spécialisées dans la présentation de l’antigène. Lorsqu’elles sont activées, lors d’une infection, ces cellules sont capables d’apprêter l’antigène et de le présenter à leur surface au sein du CMH de classe II (CMHII deperdent alors les récepteurs leur permettant d’être localisées au niveau). Elles l’inflammation (CCR6) et expriment des récepteurs de type chémokine (CCR7) qui favorisent leur migration rapide vers l’organe lymphoïde secondaire le plus proche, au niveau de la zone T. Ainsi localisées, les cellules dendritiques peuvent cribler un nombre considérable de cellules T. L’expression du ligand de CCR7 au niveau des zones T des organes lymphoïdes secondaires
permet d’attirer les lymphocytes T, qui expriment également CCR7, au niveau de cette zone. De plus, les cellules dendritiques sécrètent des chémokines qui attirent les lymphocytes T (mais également les lymphocytes B). Les cellules dendritiques remplissent ainsi très efficacement leur rôle de cellules présentatrices de l’antigène professionnelles et activent les cellules T spécifiques de l’antigène. L’importance du rôle des chémokines sécrétées par les cellules dendritiques a été montré dans la polarisation vers une réponse de type Th1 ou Th2. Cette phase d’activation des lymphocytes T constitue l’étape limitante de la réponse adaptative. Au sein du follicule, les lymphocytes B naïfs appartiennent au compartiment des lymphocytes B matures recirculant à longue durée de vie. La rencontre entre l’antigène et les cellules B peut se produire soit dans le sang, soit au niveau des zones B des organes lymphoïdes périphériques, soit à la surface des cellules folliculaires dendritiques dans le follicule. L’interaction entre l’antigène et l’immunoglobuline de surface de la cellule B constitue une première étape de son activation. Elle lui permet d’apprêter son antigène et de le présenter au sein du CMHII, et elle induit l’expression de molécules costimulatrices B7-1 et B7-2. La cellule B devient ainsi également une cellule présentatrice de l’antigène. Grâce au jeu de sécrétion de chémokines et à l’expression des récepteurs correspondants, les cellules B sont attirées vers la zone T et elles attirent les cellules T activées. La rencontre entre cellules B et T se produit donc dans la zone T externe, à la frontière avec la zone B (102 pour revue). Cette collaboration implique l’interaction de nombreuses molécules membranaires, notamment CD40 (lymphocytes B)/CD40L (lymphocytes T), molécules du CMHIIT et les molécules costimulatrices B7/récepteur CD28. Elle fait également intervenir/récepteur les cytokines sécrétées par les cellules T activées (ces cytokines diffèrent en fonction du type de réponse induite : Th1 ou Th2). Il semble que les cellules dendritiques soient capables, en plus de leur fonction d’activation des cellules T, de stimuler la prolifération de cellules B activées (40). Les cellules B ainsi activées vont majoritairement se différencier en plasmocytes à vie courte, sécrétant des immunoglobulines non mutées. Ces anticorps constituent la première ligne de défense de l’organisme contre l’agresseur. Cependant quelques lymphocytes B (cellules fondatrices) issus de cette réaction vont, grâce à des signaux encore mal connus, fonder le centre germinatif. 3) Le centre germinatif : Les cellules B fondatrices présentent le phénotype IgM+IgD+, mais expriment également le marqueur CD38 des cellules du centre germinatif. Ces cellules présentent un très faible taux de mutation, ce qui suggère que la machinerie des mutations somatiques vient juste d’être activée. Elles sont également sensibilisées à l’apoptose (perte de l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl2 et expression de Fas). Il semble donc que le processus des mutations somatiques soit acquis de manière concomitante à une sensibilité à l’apoptose lors de la formation du centre germinatif (92), ce qui aura une très grande importance lors de la sélection des cellules B, comme nous le verrons plus loin.
Les cellules fondatrices migrent vers le centre du follicule où elles débutent une phase de prolifération extrêmement intense (chaque cycle cellulaire ne durant que 6 à 7 heures). Elles se sont différenciées en centroblastes et forment la zone sombre du centre germinatif. La survie des centroblastes dépend de manière cruciale du micro-environnement de la zone sombre du centre germinatif. Ils meurent par apoptose dès qu’ils en sont retirés (49). Aux premiers stades de prolifération (J8 après stimulation antigénique) les centroblastes sont inclus dans le réseau des cellules folliculaires dendritiques (FDC) ; les cellules B naïves sont repoussées à la périphérie et forment la zone du manteau folliculaire (26). Passée la phase de prolifération et de mutation somatique, les centroblastes cessent de se diviser et entrent dans la zone claire du centre germinatif où ils se différencient en centrocytes. La structure du centre germinatif évolue donc au cours du temps pour être formée, 10 jours après stimulation, par les centroblastes, des cellules B en cours de sélection appelées centrocytes, les lymphocytes T et les cellules folliculaires dendritiques (figure 5). Les lymphocytes B PNAhighchez la souris (151) et les lymphocytes B CD38+chez l’homme (99) correspondent aux centroblastes et aux centrocytes. Dans le centre germinatif, les cellules B entrent par défaut en apoptose (92; 101). Elles doivent recevoir un signal de survie pour pouvoir proliférer et se différencier. Seuls les lymphocytes B qui auront acquis la plus forte affinité pour l’antigène, par le mécanisme de mutation somatique, recevront ce signal. Il s’agit du phénomène de sélection par l’antigène (89). Les cellules folliculaires dendritiques constituent le rouage central du processus de sélection. Ces cellules présentent en surface des complexes immuns contenant l’immunoglobuline germinale (sécrétée dans le sérum pendant la réaction extrafolliculaire). Les centrocytes sont donc en compétition pour capturer l’antigène dans ces complexes immuns. Seuls ceux dont l’immunoglobuline de surface (ou récepteur B, BCR) présente, après mutation somatique une affinité accrue pour l’antigène, pourront déplacer l’antigène de l’immunoglobuline germinale, ce qui induit leur stimulation par le récepteur B. Ils apprêtent alors l’antigène et le présentent, au sein du CMHII, aux lymphocytes T auxiliaires (spécifiques de celui-ci) du centre germinatif. Les lymphocytes T ainsi activés peuvent à leur tour fournir aux cellules B les signaux de survie et de prolifération.
4) La commutation isotypique : Les centrocytes sélectionnés subissent, dans leur grande majorité, la commutation isotypique sous l’action conjuguée du CD40L (ligand du CD40) et des cytokines sécrétées par les lymphocytes T activés, ceci probablement après le processus de mutation somatique des gènes V (100). Le processus de commutation isotypique est un élément important de la réponse immunitaire puisqu’il permet l’expression par les cellules B, d’immunoglobulines de différentes classes (ou isotypes). La commutation de classe permet l’expression de cinq isotypes d’immunoglobulines qui auront chacun une localisation tissulaire et une fonction effectrice spécifique : - les IgM sont associées en pentamères et, du fait de leur taille, sont principalement confinées
dans le sang. Elles ont essentiellement une capacité d’activation de la cascade du complément. - les IgG représentent l’isotype principal que l’on retrouve après stimulation dans le sang et le milieu extracellulaire. Elles ont la capacité de favoriser la phagocytose et peuvent activer la cascade du complément. - les IgA sont impliquées dans les sécrétions, on les retrouve notamment au niveau des muqueuses épithéliales du tractus digestif ou intestinal. Leur fonction essentielle est de neutraliser les pathogènes. - les IgE ont un rôle important dans la protection contre les parasites. Elles sont présentes à un taux faible dans le sang et le milieu extracellulaire mais leur fonction d’activation des mastocytes, au niveau de la peau, des muqueuses ou dans les tissus conjonctifs des vaisseaux sanguin, les rend notamment responsables des réactions allergiques. C’est la partie constante des chaînes lourdes (CH) qui est responsable de l’expression d’une classe d’immunoglobuline donnée. Le processus débute par l ‘apparition de coupures double-brin de l’ADN, dans des régions dites de commutation (ou « switch regions »), situées en 5’ de chacun des gènes codant pour la partie constante des différents isotypes (à l’exception du gène Cd puisque l’expression de l’IgM ou de l’IgD n’est pas due à la commutation). Avant la commutation isotypique, les cellules B activées expriment un ou plusieurs transcrits stériles germinaux, initiés dans l’intron JH-CH exon en amont de la région de commutation. Ces transcrits germinaux comportent un immédiatement en 3’ du promoteur (exon I) et s’étendent jusqu’au site de polyadénylation du gène C correspondant (163; 164 pour revues). Cependant la région de commutation (région S) est épissée et se trouve ainsi située dans l’intron des transcrits germinaux CH(figure 6). La commutation isotypique vers une classe d’immunoglobuline est donc précédée par l’apparition du transcrit stérile de la classe correspondante (161) mais son rôle n’est pas connu dans le mécanisme moléculaire de la commutation isotypique. La collaboration entre les différentes lignées cellulaires du centre germinatif semble essentielle à une efficacité optimum de la réponse immunitaire des lymphocytes B. Elle permet donc la maturation de l’affinité des immunoglobulines et la commutation isotypique, mais elle est également nécessaire à la différenciation des cellules B en plasmocytes ou en cellules à mémoire (143). Ces deux types de cellules sont identifiées par le phénotype IgM-IgD- mais les cellules à mémoire sont CD38- tandis que les plasmocytes sont CD38++ ou. Tous les autres lymphocytes activés, peu affins ayant perdu la fonctionnalité de leur récepteur par le processus de mutation somatique, meurent par apoptose et sont éliminés dans les centre germinatifs par des macrophages, les TBM (pour « Tingible Body Macrophages) (20; 28; 97; 119). D’autres cycles de mutation-sélection peuvent se produire dans le centre germinatif. La durée de cette réaction de centre germinatif permettant la maturation de la réponse immune est de 14 à 20 jours (98). L’accumulation de mutations supplémentaires dans les gènes V et l’augmentation de l’affinité des anticorps entre la réponse primaire et les réponses secondaires et tertiaires indiquent que les lymphocytes B à mémoire peuvent entrer à nouveau dans
