N° d'ordre:

Cecilia Tamborindeguy

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
N° d'ordre: 2188 THESE Présentée pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L'INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE Ecole doctorale : BIOLOGIE, SANTE, BIOTECHNOLOGIES Spécialité : BIOSCIENCES VEGETALES Par Cecilia TAMBORINDEGUY Analyse par les approches de la génomique fonctionnelle de l'induction de la polarité embryonnaire chez le tournesol Soutenue le 16 décembre 2004 devant le jury composé de : Pr. R. Pont-Lezica Université Paul Sabatier, Toulouse, Président Dr. C. Nguyen INSERM ERM 206/TAGC, Marseille, Rapporteur Dr. D. Job CNRS/INRA/Bayer CropScience, Lyon, Rapporteur Dr. A. Niebel CNRS, Toulouse, Examinateur Pr. L. Gentzbittel INP-ENSAT, Toulouse, Directeur de thèse Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse - Laboratoire de Biotechnologie et Amélioration des plantes – 18 chemin de Borde Rouge, BP107, 31326 CASTANET-TOLOSAN

• protoplastes en culture en milieu liquide


• arn acide ribonucléique


• analyse par les approches de la génomique fonctionnelle de l'induction de la polarité embryonnaire chez le tournesol


• polarité embryonnaire


• tris tris


• embryogenèse somatique


• molécules signal participant au développement des embryons somatiques……………………14


• analyse par mutagenèse

Sujets

• Institut national polytechnique de Toulouse
• Sabatier
• Institut national de la santé et de la recherche médicale
• Toulouse

Informations

• Publié par: profil-feym-2012
• Publié le: 01 décembre 2004
• Nombre de lectures: 32
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 4 Mo

Extrait

N° d’ordre: 2188


THESE

Présentée
pour obtenir le titre de
DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE

Ecole doctorale : BIOLOGIE, SANTE, BIOTECHNOLOGIES
Spécialité : BIOSCIENCES VEGETALES

Par

Cecilia TAMBORINDEGUY


Analyse par les approches de la génomique fonctionnelle de l’induction de la polarité
embryonnaire chez le tournesol




Soutenue le 16 décembre 2004 devant le jury composé de :

Pr. R. Pont-Lezica Université Paul Sabatier, Toulouse, Président
Dr. C. Nguyen INSERM ERM 206/TAGC, Marseille, Rapporteur
Dr. D. Job CNRS/INRA/Bayer CropScience, Lyon, Rapporteur
Dr. A. Niebel CNRS, Toulouse, Examinateur
Pr. L. Gentzbittel INP-ENSAT, Toulouse, Directeur de thèse


Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse - Laboratoire de Biotechnologie et
Amélioration des plantes – 18 chemin de Borde Rouge, BP107, 31326 CASTANET-TOLOSAN
Remerciements
Je tiens à remercier le Professeur L. Gentzbittel pour la confiance qu’il m’a témoigné tout au long de
ce travail, pour ses conseils et pour son enseignement. J’ai particulièrement apprécié nos discussions
portant sur la science, sur le monde et sur la vie. Je souhaite remercier également Monsieur T. Liboz
pour l’aide, le temps et l’attention qu’il m’a accordé pendant ces années. Leur direction a été pour moi
d’une grande valeur dans ma formation scientifique et une expérience enrichissante sur le plan
humain.
Je remercie le Professeur R. Pont-Lezica, Monsieur A. Niebel de me faire l’honneur de participer à
mon jury de thèse et Madame C. Nguyen et Monsieur D. Job qui ont accepté d’évaluer ce travail.
Je remercie les Professeurs G. Alibert et M. Petitprez de m’avoir accueillie dans leur laboratoire et
pour leur appui.
Je tiens également à exprimer ma gratitude à C. Ben et N. Ladouce qui m’ont accompagnée tout au
long de cette thèse en me témoignant leur amitié inconditionnelle. Je souhaiterais remercier F.
Jardinaud pour la multitude de cafés consommés en planifiant des manips géniales, pour les
discussions et l’aide qu’elle m’a apporté.
J’exprime ma reconnaissance à C. Tonon, à T. Hewezi, à S. Moretti et aux différents stagiaires qui ont
contribué à mon travail de thèse.
Une pensée particulière pour ma famille qui m’a toujours soutenue.
Enfin, merci à toute l’équipe BAP qui m’a accueillie chaleureusement. Je garderai un merveilleux
souvenir de leur amitié et de leur aide.
Résumé
L’embryogenèse dicotylédone débute par une division asymétrique qui est à l’origine du suspenseur et
de l’embryon. Les méthodes classiques de mutagenèse mises en œuvre pour élucider les mécanismes
de ce processus développemental ne sont pas adaptées pour mettre en évidence les mécanismes
d’acquisition de la polarité embryonnaire à l’origine de cette division asymétrique. L’embryogenèse
somatique est reconnue comme un modèle d’étude de l’embryogenèse zygotique chez les végétaux
supérieurs. Notamment, le modèle d’embryogenèse somatique in vitro du tournesol a été proposé
comme modèle d’étude de la première division du zygote. Dans ce modèle, un protoplaste de
tournesol mis en culture enrobé dans une matrice d’agarose (condition embryogène) se divise
asymétriquement donnant une structure appelée embryoïde alors que lorsqu’il est mis en culture en
milieu liquide (condition non-embryogène), il se divise de façon symétrique pour donner un tissu
somatique.
Nous avons construit des banques d’ADNc à partir de la culture de protoplastes en conditions
embryogènes et non-embryogènes. Une banque de référence et une banque enrichie en gènes
faiblement exprimés ont été construites pour chacune de ces conditions, générant un total de 22 876
clones d’ADNc dont 4 800 ont été séquencés. L’analyse de ces banques nous a permis d’effectuer une
première caractérisation du transcriptome des protoplastes en culture en conditions embryogènes et
non-embryogènes. Ces banques ont par la suite permis la construction de microarrays sur nylon. Les
puces à ADN ont été hybridées avec des ADNc issus des deux conditions étudiés (protoplastes en
culture en conditions embryogènes et en culture en conditions non-embryogènes), ainsi qu’avec des
ADNc issus de protoplastes fraîchement isolés et de protoplastes fraîchement inclus. L’analyse des
microarrays nous a permis d’identifier 369 gènes différentiellement exprimés entre au moins deux
conditions. L’analyse du profil d’expression de ces gènes nous a permis de dégager des hypothèses sur
les mécanismes d’induction de la polarité embryonnaire faisant intervenir l’hormone auxine, un signal
calcique et la sécrétion de composés pariétaux.







Mots clés : Helianthus annuus, protoplaste, agarose, embryoïde, embryogenèse somatique, EST,
microarray


ABREVIATIONS

2-4D acide 2,4-dichlorophénoxyacétique
ADN Acide désoxyribonucléique
ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire
ANA Acide Naphtalène-Acétique
ARN Acide ribonucléique
ARNm Acide ribonucléique messager
BAP 6-Benylaminopurine
BET Bromure d’éthidium
bp Paire de base
cDNA-AFLP Complementary désoxyribonucleic acid- amplified fragment length
polymorphism
Dnase Désoxyribunucléase
dNTP Désoxynucléotides triphosphate
EDTA Acide Ethylène Diamine Tétra-acétique
EST Expressed Sequence Tag
MS Milieu de Murashige et Skoog
MLc Protoplastes en culture en milieu liquide
MLt0 Protoplastes fraîchement isolés
MSc Protoplastes en culture en milieu solide
MSt0 Protoplastes fraîchement inclus
PCR Polymerase Chain Reaction
QTL Quantitative trait loci
RNAi RNA interference
RT-PCR Reverse transcription - PCR
SDS Sodium Dodécyl Sulfate
SSC Salt Sodium Citrate
SSH Suppressive subtractive hybridization
TAE Tampon Acétate EDTA
TLD milieu L4 de Chupeau modifié
Tris Tris (hydroxyméthyl)-méthylamine

TABLES DES MATIERES

INTRODUCTION…………………………………………………...….……...1
I. L’EMBRYOGENESE CHEZ LES VEGETAUX SUPERIEURS……………………..………....2
A. Le développement embryonnaire débute lors de la fécondation………………………………...4
1) Les acteurs de la fécondation…………………………………………………..…………….……………….4
2) La double fécondation, une caractéristique des Angiospermes……………………….…….……………4
B. Description morphologique de l’embryogenèse………….……………………...………………..5
C. Description du programme génétique impliqué au cours du développement embryonnaire….7
1) L’inégalité des sexes lors de la mise en place de l’embryogenèse………………….……………………7
2) L’analyse par mutagenèse : une source prolifique mais insuffisante………….……..……………….…7
a) Etablissement de l’embryogenèse : la mutation de GNOM/EMB30……………………………..…..8
b) Suspenseur versus embryon……………………………………………………………...…………..9
c) Mutations affectant différents éléments de l’axe apico-basal……………………………..………….9
3) L’analyse génomique, une approche prometteuse……………………………………………………...…11
a) Approche par screening différentiel……………………………………...…………………………11
b) Approches EST et microarrays………………………...……………………………………………11
4) L’embryogenèse somatique, un bon modèle d’étude du développement embryonnaire……………..13
a) Présentation de l’embryogenèse somatique……………………………………………………...….13
b) Analyse de l’embryogenèse somatique par la génomique……………………………….…………14
c) Les molécules signal participant au développement des embryons somatiques……………………14
D. Le contrôle hormonal de l’embryogenèse…………………………………….………………….15
1) L’auxine joue un rôle important tout au long de l’embryogenèse précoce…………………………....15
2) Le rôle des cytokinines au cours de l’embryogenèse précoce reste à déterminer……………….……16
3)Autres molécules signal impliquées dans le développement embryonnaire……………………….…...16
E. L’albumen, l’autre organe issu de la double fécondation…………………………………..…..17
F. Conclusion……………………………………………………………………………...…………..17
II. LA POLARITE……………………………………………………………………………………18
A. Induction de la polarité lors du développement embryonnaire……………………………..….18
1) La polarité peut être d’origine maternelle……………………………………………………………..…..19
a) La polarité peut être définie lors de l'élaboration des organes reproducteurs femelle………………19
b)