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Submitted to obtain the degree of

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185 pages
Niveau: Supérieur

  • dissertation


Dissertation Submitted to obtain the degree of Docteur de l'Université Louis Pasteur Strasbourg I Speciality : Life sciences Molecular and cellular aspects of biology By François-Xavier BLÉ Lung magnetic resonance imaging as a non-invasive alternative to assess experimental pulmonary diseases in small rodents Public defense held on December 3rd, 2007 Defense committee Thesis Director Dr Nelly FROSSARD, Faculté de Phamarcie, Illkirch Thesis Co-director Dr Nicolau BECKMANN, Novartis Pharma AG, Basel Internal Referee Prof Daniel GRUCKER, IPB, Strabourg External Referee Prof Vincent LAGENTE, Faculté des sciences, Rennes External Referee Dr Yannick CRÉMILLIEUX, UCB, Lyon

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Dissertation
Submitted to obtain the degree of

Docteur de l’Université Louis Pasteur Strasbourg I

Speciality : Life sciences
Molecular and cellular aspects of biology

By François-Xavier BLÉ



Lung magnetic resonance imaging as a
non-invasive alternative to assess experimental
pulmonary diseases in small rodents




rdPublic defense held on December 3 , 2007





Defense committee

Thesis Director Dr Nelly FROSSARD, Faculté de Phamarcie, Illkirch
Thesis Co-director Dr Nicolau BECKMANN, Novartis Pharma AG, Basel
Internal Referee Prof Daniel GRUCKER, IPB, Strabourg
External Referee Prof Vincent LAGENTE, Faculté des sciences, Rennes
External Referee Dr Yannick CRÉMILLIEUX, UCB, Lyon





Thèse
Présentée pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université Louis Pasteur Strasbourg I

Discipline: Sciences du vivant
Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

par François-Xavier BLÉ



Imagerie par résonance magnétique des
poumons: un outil non invasif de
caractérisation de modèles expérimentaux des
maladies respiratoires chez le petit rongeur




Soutenue publiquement le 3 décembre 2007





Membres du Jury

Directeur de thèse Dr Nelly FROSSARD, Faculté de Phamarcie, Illkirch
Co-directeur de thèse Dr Nicolau BECKMANN, Novartis Pharma AG, Basel
Rapporteur interne Prof Daniel GRUCKER, IPB, Strabourg
Rapporteur externe Prof Vincent LAGENTE, Faculté des sciences, Rennes Dr Yannick CRÉMILLIEUX, UCB, Lyon Lung MRI as Non-Invasive alternative to assess experimental pulmonary diseases in small rodents

TABLE OF CONTENT

FRENCH SUMMARY............................................................................................. 1
FOREWORD............................................................................................................... 8
GENERAL INTRODUCTION ........................................................................... 11
1. Respiratory diseases and animal models .............................................................. 12
2. Evaluation of pulmonary diseases models ............................................................ 14
2.1. Imaging Pulmonary diseases models .......................................................... 15
2.2. Magnetic Resonance Imaging (MRI) ......................................................... 16
2.2.1. MRI historical.........................................................................................16
2.2.2. MRI basics ............................................................................................... 18
2.2.3. MRI Principle.......................................................................................... 19
2.2.4. MRI of the lung ....................................................................................... 25
3. Investigated models and proton MRI expectations ............................................. 27
3.1. Allergen-induced airway inflammation in sensitized mice........................ 28
3.2. Lipopolysaccharide-induced mucus hypersecretion rat airways ............. 31
3.3. Hypertonicity-induced hydration of the airway secretion in rats ............ 34
3.4. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice......................................... 36

OBJECTIVES OF THE THESIS ...................................................................... 39
ORGANISATION OF THE THESIS............................................................... 40
MANUSCRIPT 1: Allergen-induced lung inflammation in actively
sensitized mice assessed by MRI.................................................................................. 41
ADDITIONAL DATA: Time course of lung fluid signals assessed by MRI in
a murine model of allergen-induced inflammation: a comparison of two strains .. 60 Lung MRI as Non-Invasive alternative to assess experimental pulmonary diseases in small rodents

MANUSCRIPT 2: Intranasal instillation of FTY720 reduces lung MRI fluid
signals in a murine model of allergen-induced inflammation: example of a S1P1
agonism ......................................................................................................................... 75
MANUSCRIPT 3: A S1P2 antagonist inhibits allergen-induced increase in
MRI fluid signals in mouse via a non mast cell-dependent mechanism................... 93
MANUSCRIPT 4: In-vivo assessments of mucus dynamics in the lungs using
a Gd-Cy5.5-bilabeled contrast agent......................................................................... 111
MANUSCRIPT 5: ENaC-mediated effects assessed by proton MRI in a rat
model of hypertonic-induced hydration of airways ................................................ 131
PRELIMINARY REPORT: Bleomycin-induced lung injury assessed non-
invasively and in spontaneously breathing mice by proton MRI .......................... 152
GENERAL DISCUSSION.................................................................................. 167
CONCLUSION ....................................................................................................... 175
REFERENCES 178
LIST OF PUBLICATIONS AND PRESENTATIONS ........................... 189
ACKNOWLEDGEMENTS................................................................................ 192 Lung MRI as Non-Invasive alternative to assess experimental pulmonary diseases in small rodents

TABLE OF ABBREVIATIONS
Abbreviation Description
-6µM Micro (x10 ) molar
2DFT Two-dimensional Fourier Transformation
AB/PAS Alcian blue/ periodic acid Schiff’s staining
ADC Apparent diffusion coefficient
ASL Airway surface liquid
ASM Airway smooth muscle
B Homogeneous magnetic field 0
BAL Bronchoalveolar lavage
BLM Bleomycin
BN Brown Norway
b.w. Body weight
CCD Charged coupled device
CF Cystic Fibrosis
CFTR Chloride Cystic Fibrosis Transepithelial Receptor
Compound Condensation product of p-methoxphenethyl methylamine with
48/80 or c48/80 formaldehyde. Mixture of low molecular weight polymers
having a degree of polymerization between 3 and 6.
COPD Chronic obstructive pulmonary disease
DMSO Dimethylsulphoxide
DSCG Di-sodium-cromoglycate
EDTA Ethylenedaminetetraacetic acid
EGFR Epithelial growth factor receptor
EIPA Ethylisopropyl amiloride
ENaC Epithelial Natrium Channel
EPO Eosinophil peroxidase
et al. et alia; and others
High affinity receptors for IgE FcεRI
fMRI Functional magnetic resonance imaging
FOV Field of view Lung MRI as Non-Invasive alternative to assess experimental pulmonary diseases in small rodents

g Gram
Gd-DTPA Gadolinium and diethylenetriaminepentaacetic acid complex
h Hour
HBSS Hank's balanced salt solution
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulphonic acid
HS Hypertoninc saline
Hz Hertz
i.p. Intraperitoneally
i.t. Intratracheally
i.v. Intravenously
Ig Immunoglobulin
IL- Interleukin-
INF Interferon
kg Kilogram
l Litre
LPS Lipopolysaccharide
LT Leukotriene
Microgram µg
mg Milligram
min Minute
ml Millilitre
-3mM Milli (x10 ) molar
MCC Mucociliary clearance
MPO Myeloperoxidase
MR Magnetic resonance
MRI Magnetic resonance imaging
mRNA Messenger ribonucleic acid
n Number of replicates
ºC Degrees centigrade
OPD O-phenylenediamine
OVA Ovalbumin
p.o. Per os (by gavage) Lung MRI as Non-Invasive alternative to assess experimental pulmonary diseases in small rodents

per se By its very nature; intrinsically
PET Positron-emission tomography
PG Prostaglandin
pH -log hydrogen ion concentration 10
RF Radiofrequency
R Airway resistance L
ROI Region of interest
rpm Revolutions per minute
s Second
S1P Sphingosine-1-Phosphate
S1P Sphingosine-1-Phosphate receptor subtype X
SEM Standard error of the mean
T Tesla (1T = 10 000 gauss) defines intensity of a magnetic field
T1 Longitudinal relaxation time
T2 Transversal relaxation time
T2* al relaxation time, taking into account microscopic
magnetic field inhomogeneities
TE Echo time (The time between the RF pulse and the echo signal)
TNF Tumour necrosis factor
TR Repetition time (the time interval with which the RF pulse
sequence is repeated)
TRIS Tris(hydroxymethyl)-amnithan
U Units
UTP Uridine Tri-Phosphate
Alpha α
Beta β
Magnetic moment µ
Larmor frequency ω
Gyromagnetic ratio γ
RF flip angle θ
Lung MRI as Non-Invasive alternative to assess experimental pulmonary diseases in small rodents

FRENCH SUMMARY

Les maladies respiratoires et pulmonaires incluant l’asthme, les bronchopathies
chroniques obstructives (BPCO), la fibrose, la pneumonie, le cancer du poumon et
bien d’autres, comptent parmi celles dont l'incidence et la morbidité ont le plus
considérablement augmenté dans les pays industrialisés au cours des dernières
décennies. L’observation et la compréhension des mécanismes physiologiques
impliqués dans ces pathologies sont essentielles pour progresser dans la connaissance
de ces maladies et la recherche de nouveaux traitements. L’utilisation de modèles
expérimentaux chez les petits rongeurs est essentielle dans ce domaine de recherche
mais, bien souvent, les méthodes d’évaluation sont limitées par le fait qu’elles soient
terminales (mesure de résistance bronchique, analyse des paramètres inflammatoire
du lavage broncho-alvéolaire (BAL), analyse histologique) et/ou qu’elles fournissent
seulement des informations globales sur la fonction pulmonaire (pléthysmographie).
Lors de cette thèse, l’imagerie par résonnance magnétique (IRM) du proton a été
utilisée afin de valider un outil non-invasif, alternatif à ces méthodes et capable de
fournir des informations d’ordre spatial et temporel en corrélation avec l’évolution et
le statut pathophysiologique des poumons, dans plusieurs modèles de maladies
respiratoires chez le petit rongeur.

Les contrastes observés sur les clichés IRM proviennent d’une différence de
propriétés des tissus, principalement influencées par la densité et la mobilité des
protons (de l’eau et des graisses), ainsi que par leur environnement moléculaire. Le
poumon est un des organes les plus difficiles à imager par l‘IRM. En effet, en plus
des artéfacts de mouvements liés à la respiration et au rythme cardiaque, sa structure
aérifère lui confère une densité de proton significativement plus faible que tout autre
tissu. S’ajoute à cela, la différence de susceptibilité à l’interface tissu/air qui est
source d’hétérogénéités locales du champ magnétique, responsable d’une perte de
signal très marquée au niveau du parenchyme pulmonaire. Cette absence de signal se
traduit par une apparence très sombre, proche de celle du bruit de fond sur les images
RMN mais constitue cependant un excellent contraste avec les sécrétions de fluides,
les fuites plasmatiques ou la densification de tissu qui peuvent être caractéristiques
- 1 - Lung MRI as Non-Invasive alternative to assess experimental pulmonary diseases in small rodents
de phénomènes pathophysiologiques décrits dans plusieurs modèles de maladies
pulmonaires chez les petits rongeurs. Afin d’estimer les apports possibles de l’IRM
du poumon pour ces espèces, quatre modèles ont été étudiés durant la thèse:
1) l’évaluation du statut inflammatoire des poumons dans un modèle
d’inflammation pulmonaire allergénique chez la souris, et la validation de ce
modèle dans une étude pharmacologique,
2) la validation in vivo de l’utilisation d’un agent de contraste permettant l’étude
de la dynamique du mucus dans un modèle d’hypersécrétion provoquée par
instillation d’une endotoxine chez le rat,
3) l’évaluation de composés permettant l’hydratation des sécrétions des voies
aériennes induite par solution hypertonique dans un modèle non-
inflammatoire chez le rat,
4) et l’étude longitudinale d’un modèle de fibrose induite par bléomycine chez
la souris.

Dans un premier temps, le projet a consisté à valider l’utilisation de l’IRM afin
de caractériser un modèle d’inflammation allergénique pulmonaire chez la souris
(publication 1). En s’appuyant sur les travaux précédemment menés chez le rat, la
première partie du travail de thèse a été dédiée au transfert vers la souris, du modèle
biologique mais également de la méthode d’imagerie et d’analyse. L’étude du
modèle d’inflammation pulmonaire développé chez la souris a consisté à
l’administration intranasale et de manière répétée d’un allergène, l’ovalbumine, ou
de son contrôle, une solution saline physiologique, chez des souris femelles BALB/c
préalablement sensibilisées à l’allergène. Les examens IRM des poumons de souris
ont été effectués une fois (24h après la 4ème provocation) ou plusieurs fois, entre et
après les provocations allergéniques afin de déterminer les volumes de fluides
sécrétés dans les voies aériennes en réponse à l’allergène. Pour la première fois dans
ce modèle, les images de souris en respiration spontannée mais sous anesthésie
gazeuse ont été acquises sans synchronisation avec le rythme cardiaque ou
respiratoire. Les signaux détectés en utilisant une séquence d’écho de gradient ont été
ensuite comparés avec les paramètres du lavage broncho-alvéolaire (BAL) ainsi
qu’avec la présence éventuelle d’oedème périvasculaire et péribronchique et/ou de
- 2 - Lung MRI as Non-Invasive alternative to assess experimental pulmonary diseases in small rodents
mucus observés par analyse histologique des poumons. Malgré l’absence de
synchronisation, la netteté des images obtenues a permis l’évaluation quantitative des
ème èmeréponses. Lors de la phase précoce (de la 2 provocation jusqu’à 24h après la 4 ),
des signaux intenses et massifs (volume de 40 à 50 microlitres) ont été détectés dans
la partie antérieure des poumons. Soixante-douze heures après la dernière
provocation, les signaux toujours en présence (environ 20 microlitres) étaient de plus
faible intensité et de texture moins régulière. Les analyses des données du BAL et de
l’histologie ont permis d’identifier l’origine des signaux de la phase précoce comme
étant majoritairement oedémateuse alors qu’en phase tardive la présence de mucus
dans les voies aériennes était principalement responsable des signaux observés par
IRM. Ces résultats valident l’utilisation de l’IRM comme une méthode non-invasive
d’évaluation de ce modèle d’inflammation pulmonaire chez la souris et ont fourni les
bases nécessaires à l’étude de traitements pharmacologiques potentiels.
Souhaitant profiter de l’utilisation de souris transgéniques dans le cadre d’une
étude pharmacologique pour valider ce modèle, nous avons au préalable établi une
comparaison des souches de souris BALB/c, les plus décrites dans des nombreux
modèles de sensibilité antigéniques, et des souris C57BL/6, majoritairement utilisées
dans la genèse de souris transgéniques. Des différences notables au niveau de la
course des signaux entre et après les provocations allergéniques ont été observées
mais l’analyse du BAL et des coupes histologiques ont permis de mettre en évidence
les mêmes caractéristiques de l’inflammation pouvant être impliquées dans les
signaux IRM : fuite plasmatique et sécrétion de mucus.

Une fois la caractéristaion de notre modèle établie, la pertinence de l’application
de la méthode d’IRM à des fins pharmacologiques a été illustrée dans des études en
utilisant des outils pharmacologiques sélectifs et des souris génétiquement modifiées.
Dans ces études, les effets d’un composé anti-inflammatoire ont été détectés par IRM
et confirmés par histologie et par analyse du BAL (publication 2). En s’intéressant à
la pharmacologie du sphingosine-1-phosphate (S1P), l’influence de la fuite
plasmatique sur la détection des signaux a été mise en évidence dans notre modèle
d’inflammation des voies aériennes chez la souris. Le FTY720, un agoniste de 4 des
5 récepteurs au S1P (S1P to , except S1P ), et l’agoniste sélectif du S1P : AUY954 1 5 2 1
- 3 -