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Ecole Pratique des Hautes Etudes – Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines  
Thèse présentée pour l’obtention du : Diplôme de Doctorat de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes et de l’Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines Spécialité : Biologie cellulaire et moléculaire Soutenue publiquement le 19 Décembre 2008  
parChristine GRANOTIER Née le 23 Août 1972 à Rennes (35)  Conséquences d’une atteinte des télomères par un ligand des G-quadruplexes dans des cellules humaines normales et cancéreuses   Président du jury : M. le Docteur Andras PALDI Rapporteurs : Mme. le Docteur Sophie BOMBARD  M. le Docteur Jozo DELIC Directeur de thèse : M. le Professeur Jean-Luc VAYSSIERE Directeur des recherches : M. le Docteur François BOUSSIN     Laboratoire de Génétique et Biologie cellulaire M. Jean-Luc VAYSSIERE UMR8159 CNRS/UVSQ - EPHEv.yal-cuejnafrq.vs@ureiess 45 avenue des Etats-Unis 78035 Versailles Cedex
Laboratoire de RadioPathologie M. François BOUSSIN CEA/DSV/iRCM francois.boussin@cea.fr 18 Route du Panorama 92265 Fontenay-Aux-Roses Cedex
 Les télomères humains contribuent à la régulation des capacités de prolifération des cellules et à la stabilité  en empêchant que les extrémités des chromosomes soient reconnues comme des dommages de  Cependant, la protéine kinase ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) qui joue un rôle crucial dans l cellulaire aux dommages de l’ADN participe à la maintenance des télomères. Le simple-brin télomérique  in vitro spécialisée dans desstructures G-quadruplexes qui inhibent la télomérase, la transcriptase inverse des télomères et réactivée dans 90 % des cancers. Nous avons donc étudié la localisation intracellulaire  nouveau ligand des G-quadruplexes, ses effets au niveau des télomères et leurs conséquences dans de
humaines normales et cancéreuses.  Par autoradiographie de chromosomes métaphasiques, nous avons démontré la fixation préférentielle du marqué au tritium à l’extrémité des chromosomes des cellules cancéreuses. La présence du ligand au niveau  indépendante de leur taille, apporte un argument majeur en faveur de la formationin vivo G- des dans des cellules humaines cancéreuses.  Nous avons ensuite montré que l’effet anti-prolifératif irréversible du ligand des G-quadruplexes d’un arrêt du cycle cellulaire (en phase S et/ou G2/M), de l’activation d’une réponse aux dommages  dépendante d’ATM et aboutit à une mort cellulaire par apoptose. Si la présence du ligand des G- aux extrémités des chromosomes ne provoque pas de raccourcissement télomérique, elle induit la  de l’extrémité simple-brin. La technique d’hybridation des télomères avec une sonde PNA FISH (Fluorescencein situHybridation) a révélé que le ligand provoquait la formation d’aberrations  surtout pendant ou après la réplication, principalement des fusions de télomères entre chromatides  et des recombinaisons. La technique de CO-FISH (Chromosome Orientation Fluorescencein situ utilisant deux sondes PNA fluorescentes spécifiques des brins G et C télomériques a montré que ces télomériques résultaient préférentiellement d’une atteinte sélective du brin G télomérique matriciel.  Nous avons ensuite montré que la déficience d’ATM accentue l’instabilité télomérique induite par le ligan  G-quadruplexes. L’augmentation du nombre des aberrations télomériques induite par la déficience d’ATM relation avec un défaut de contrôle du cycle cellulaire ou une induction d’apoptose, dévoile le rôle protecteu cette kinase jouerait au niveau des télomères en empêchant une réparation inappropriée et/ou en favorisant la d’une structure protégée. Enfin, nous avons évalué les effets du ligand des G-quadruplexes dans des cellules humaines normales après vérifié que le ligand se fixait bien préférentiellement au niveau de leurs télomères. Même à fortes doses, la du ligand des G-quadruplexes n’induit qu’un ralentissement de la croissance cellulaire, sans augmentation  ni instabilité télomérique dans des cultures primaires de lymphocytes et de fibroblastes normaux nous avons observé l’activation d’un programme réversible de sénescence dans les fibroblastes. Au total, nous avons montré que le ligand provoque la formation d’aberrations télomériques uniquement  les cellules cancéreuses. Les effets du ligand des G-quadruplexes suggèrent que l’organisation et/ou la  aux dommages des télomères différent de manière très significative entre les cellules normales e éreuses. Au final, au-delà de l’intérêt thérapeutique, l’utilisation des ligands des G-quadruplexes télomériques  un outil de choix pour l’étude des télomères et des mécanismes activés dans le cadre d’un télomérique.   s clés: télomère, G-quadruplexe, cellules normales, cellules cancéreuses, ATM
DES MATIERES
TABLE DES MATIERES 3
ABRÉVIATIONS 5
INTRODUCTION 7
GÉNÉRALITÉS 8
1. LES TÉLOMERES 10
1.1 L’ADNTÉLOMÉRIQUE 10 1.2 LES PROTÉINES TÉLOMÉRIQUES 11
1.3 LA STRUCTURE TRIDIMENSIONNELLE DES TÉLOMÈRES EN BOUCLET 14
2. LA TÉLOMÉRASE 15
3. LES RÔLES DES TÉLOMÈRES 16
3.1 LE RÔLE DE PROTECTION DU GÉNOME 16 3.2 EFFET POSITIONNEL SUR LA TRANSCRIPTION 16 3.3 LE RACCOURCISSEMENT TÉLOMÉRIQUE ET LINDUCTION DE LA SÉNESCENCE 17 3.3.1 LE RACCOURCISSEMENT DES TÉLOMÈRES ET LHORLOGE MITOTIQUE 17 3.3.2 LES TÉLOMÈRES INDUISENT LA SÉNESCENCE RÉPLICATIVE 18 3.4 LES TÉLOMÈRES,LA TÉLOMÉRASE ET LONCOGENÈSE 21
4. LA MAINTENANCE DES TÉLOMÈRES 21
4.1 LA RÉPLICATION DES TÉLOMÈRES 22 4.2. L’ÉLONGATION DES TÉLOMÈRES PAR LA TÉLOMÉRASE 24 4.3 LA RÉGULATION DE LA TAILLE DES TÉLOMÈRES 25 4.3.1 LA RÉGULATION DE LA TAILLE DES TÉLOMÈRES LIÉE À LA STRUCTURE 25 4.3.2 LA RÉGULATION DE LA TÉLOMÉRASE 26 4.3.3 LA RÉGULATION DE LA TAILLE DES TÉLOMÈRES PAR LES PROTÉINES TÉLOMÉRIQUES 27 4.3.4 LA RÉGULATION EUÉPÉNIGIQÉT DES TÉLOMÈRES 29 4.3.5 UNE NOUVELLE VOIEARN 29
5. LES MÉCANISMES DE RÉPARATION 30                                                                 
5.1 LE MÉCANISME DE RÉPARATIONNHEJ 31 5.2 LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE 32
6. LA SIGNALISATION INTRACELLULAIRE AU NIVEAU DES TÉLOMÈRES 33
6.1 L’INHIBITION DE LA RÉPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADNAU NIVEAU DES TÉLOMÈRES 33 6.2 LE ENTNNEMCTIONOFSYD TÉLOMÉRIQUE INDUIT UNE RÉPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADN 34
7 LA RECOMBINAISON DES TELOMERES ET L’INSTABILITÉ CHROMOSOMIQUE 35
7.1 L’INSTABILITÉ TÉLOMÉRIQUE ASSOCIÉE AU MÉCANISMENHEJ 36 7.2 L’INSTABILITÉ TÉLOMÉRIQUE ASSOCIÉE À LA RECOMBINAISON HOMOLOGUE 39 7.3 LA MAINTENANCE DES TÉLOMÈRES PAR DES MÉCANISMES SFITANRETLA 40
8. LA TÉLOMÉRASE ET LES STRATÉGIES ANTICANCÉREUSES 42
9. LES STRATÉGIES ANTICANCÉREUSES QUI CIBLENT LES TÉLOMÈRES 43
9.1 LESG-PUELAURDQSXE 43 9.2 LESG-AUQSEXELPURD TÉLOMÉRIQUES IN VITRO 44 9.3 LESG-QUADRUPLEXES NON-TÉLOMÉRIQUES 45 9.4 LES PROTÉINES CAPABLES DE SE FIXER SUR LESG-ELPURDAUQSXE 47 9.5 LES LIGANDS DESG-ADQUPLRUESEX 48
10. OBJECTIFS DE LA THÈSE 50
BIBLIOGRAPHIE 52
ABRÉVIATIONS  9.1.1 Rad9/Radi1/Hus1 A Adénine ADN Acide désoxyribonucléique ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire ADP Adénosine diphosphate  ALT Alternative Lenthening of Telomeres APB Alternative PML Bodies ARN Acide ribonucléique ARNm Acide ribonucléique messager AT Syndrome d’Ataxia Telangiectasia ATR ATM Rad3-related protein       ATM Protéine kinase mutée chez les patients atteints d’Ataxia télangiectasie ATP Adénosine triphosphate BLM Protéine hélicase mutée chez les patients atteints du syndrome de Bloom BMVC 3,6-bis 1-methyl-4-vinylpyridium carbazole diiodide C Cytosine CDK Protéine kinase qui interagit avec les cyclines pour permettre le passage dans les différentes phases du cycle cellulaire CO-FISH Chromosome Orientation-FISH DAPI 4’, 6-diamine-2’-phenylindole dihydrochloride DC Dyskératose congénitale due à la mutation de la protéine dyskérine DMSO Dimethylsulfoxyde DP Doublement de population D-loop Diplacement loop DNA-PK DNA-dependent Protein Kinase EBV Epstein Barr Virus ECTR Extra Chromosomal Telomeric Repeat ERCC1/XPF Exicion Repair Cross Complementing 1/Xeroderma Pigmentosum Factor FITC Isothiocyanate de fluorescéine FISH Fluorescence In Situ Hybridization G Guanine G-QN1 G-Quartet Nuclease 1 Gy Gray HIF-1a Hypoxia inductible factor 1a hnRNP heterogeneous nuclear RiboNucleo Protein HPV Human papilloma virus 16 Kb Kilobases KDa Kilodalton MAPK Protéine kinase activées par des agents mitogènes MRE11 Protéine mise en évidence par son implication dans la recombinaison méiotique chez   Saccharomyces cerevisiae NBS1 Protéine mutée chez les patients atteints du syndrome de Nijmengen NHEJ Non Homologous End-Joining NLS Signal de localisation nucléaire PARP Poly(ADP-ribose) polymérase Pb Paire de bases                 PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen PCR Polymerase Chain Reaction PHA Phytohemagglutinin PI3-K Protéine kinase phosphatidyl inositol 3 PML Promyelocytic Leukemia PNA Peptid Nucleic Acid POT1 Protection Of Telomere 1
RAP1 Repressor activator protein 1 Rb Protéine mutée chez les patients atteints de rétinoblastome RH Recombinaison Homologue RPA Replication Protein A SA-b-Gal b-galactosidase associée à la sénescence SCE Sister Chromatid Exchange STIR Répétition de motif télomérique dégénéré et intercalée dans les sub-télomères SV40 Simian virus 40 SVF Sérum de veau fœtal T Thymine Tankyrase TRF1-interacting ankyrin related ADP-ribose polymerase TAS Séquence associée aux télomères car peu dégénérée et contenue dans les sub-télomères TEP1 Telomerase Protein component 1 TERT Sous-unité catalytique de la télomérase TI Transcriptase inverse TIF Telomere dysfunction Induced Foci TIN2 TRF1-Interacting Nuclear Factor 2 T-loop Telomeric loop TPE Telomere Position Effect TPP1 TINT1-PIP1-PTOP1 TR Sous-unité ribonucléique de la télomérase TRD Telomere Rapid Deletion TRAP Telomeric Repeat Amplification Protocol TRF1 Telomeric Repeat binding Factor 1 TRF2 Telomeric Repeat binding Factor 2 TRFH TRF homology T-SCE Telomere-SCE UA Unité arbitraire WRN Helicase Werner g-H2AX forme phosphorylée de l’histone H2AX           
INTRODUCTION
GÉNÉRALITÉS  Décris pour la première fois dans les années 1940 par Barbara McClintock, les télomères sont des structures nucléoprotéiques situés à l’extrémité des chromosomes (McClintock, 1939). Constitués de nombreuses répétitions d’une séquence nucléotidique riche en guanine sur lesquelles sont fixées des
protéines spécifiques, les télomères protègent les extrémités des chromosomes des dégradations exonucléotidiques, empêchent les recombinaisons illégitimes par fusion, et empêchent que l’extrémité des chromosomes ne soit reconnue comme une cassure d’ADN double-brin. Parallèlement à ce rôle de gardien de la stabilité chromosomique, les télomères joueraient le rôle d’une horloge mitotique en limitant la capacité de prolifération des cellules.  En effet, en l’absence de mécanisme compensatoire, la taille des télomères de la plupart des cellules somatiques diminue aux cours des divisions cellulaires à cause entre autres des problèmes de réplication des régions terminales des ADN linéaires. L’érosion progressive des télomères des cellules primaires, cultivéesin vitro, observée par Hayflick dès 1961, représenterait la base moléculaire de la sénescence réplicative. Bloquant la prolifération cellulaire, la sénescence réplicative interviendrait au cours du vieillissement et dans la prévention des tumeurs.  La télomérase est une transcriptase inverse spécialisée dans l’élongation des télomères. Fortement réprimée ou peu exprimée dans la plupart des cellules somatiques normales, elle est en revanche exprimée dans les cellules germinales et dans certaines cellules somatiques à forte capacité de prolifération (cellules souches et progéniteurs) ou à fort taux de renouvellement (lymphocytes T) et surtout réactivée dans la grande majorité des cancers. Même si sa réactivation représente une étape nécessaire, mais non suffisante à l'oncogenèse, la télomérase est le marqueur le plus ubiquitaire des cancers. Conférant aux cellules tumorales une capacité de prolifération quasi-illimitée, la télomérase est devenue une cible d’intérêt pour l’élaboration de thérapies antitumorales. Différentes stratégies sont actuellement développées pour inhiber directement la télomérase et par conséquent limiter la croissance ou induire la mort des cellules tumorales.  Parallèlement aux programmes thérapeutiques qui cherchent à cibler directement la télomérase, une autre stratégie consiste à vouloir inhiber son activité enzymatique encisdirectement au niveau des télomères.In vitro, le brin riche en guanines des télomères  d’adopter(brin G) serait en effet capable une structure à quatre brins impliquant des quatuors de guanine (G4 ou G-quadruplexe) dont la stabilisation bloquerait la télomérase. L’utilisation de ligands capables de se fixer sur les G4 télomériques pourrait perturber le bon fonctionnement du système télomère/télomérase. L’idée consistait à penser que les ligands G4 empêcheraient la télomérase de compenser le raccourcissement télomérique qui induirait à terme la mort des cellules tumorales.  Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à participer à la caractérisation des conséquences d’une atteinte des télomères par un ligand des G-quadruplexes. Dans cette optique, : 1) nous avons étudié les effets cellulaires dans des lignées humaines tumorales de plusieurs molécules dérivées de pyridine sélectionnéesin vitro pour ses capacités de fixation sur les G-quadruplexes et d’inhibition de la télomérase, 2) par autoradiographie, nous avons apprécié la localisation intracellulaire d’une de ces molécules (360A marquée au tritium) dans des cellules vivantes humaines normales et cancéreuses, 3) nous avons ensuite cherché à caractériser les effets moléculaires que ce ligand 360A provoque dans des cellules tumorales en évaluant le rôle de la kinase ATM impliquée dans les mécanismes de réparation des dommages de l’ADN,
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