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Modulation de l'activité d'ovocyte par un régime calcique artificiel initiant des altérations de la méthylation de l'ADN et du développement chez la souris

De
48 pages
Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE Ecole Pratique des Hautes Etudes Section : Sciences de la Vie et de la Terre THÈSE de DOCTORAT Discipline : Biologie du développement TÓTH Szabolcs Modulation de l'activité d'ovocyte par un régime calcique artificiel initiant des altérations de la méthylation de l'ADN et du développement chez la souris Directeur de thèse : Dr. András Páldi Soutenue le 19 décembre 2005 Membres du jury : Dr. Bernard Mignotte Dr. Brigitte Lefevre Dr. Xavier Vignon Dr. Andras Paldi Dr. Jean-Pierre Ozil Responsable EPHE : Dr. Andras Paldi, GENETHON, 1bis, rue de l'internationale BP 60 - 91002 Evry cedex – France, Laboratoire du stage : Pulse-ions, INRA, BDR, 78352 Jouy-en-Josas Cedex, – France directeur du labo : Dr. Jean-Pierre Ozil, EPHE Banque de Monographies SVT 1

  • gène ‘insulin like

  • ovocyte en stade métaphase

  • altérations de la méthylation de l'adn et du développement chez la souris

  • développement

  • reprogrammation épigénétique

  • activation

  • altérations épigénétiques

  • nouvelle plateforme pour les analyses moléculaires


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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE  Ecole Pratique des Hautes Etudes Section : Sciences de la Vie et de la Terre THÈSE de DOCTORAT Discipline : Biologie du développement   TÓTH Szabolcs Modulation de l’activité d’ovocyte par un régime calcique artificiel initiant des altérations de la méthylation de l’ADN et du développement chez la souris   Directeur de thèse : Dr. András Páldi Soutenue le 19 décembre 2005  Membres du jury : Dr. Bernard Mignotte Dr. Brigitte Lefevre Dr. Xavier Vignon  Dr. Andras Paldi  Dr. Jean-Pierre Ozil                                            Responsable EPHE : Dr. Andras Paldi, GENETHON, 1bis, rue de l'internationale BP 60 - 91002 Evry cedex – France,paldi@genethon.fr  Laboratoire du stage : Pulse-ions, INRA, BDR, 78352 Jouy-en-Josas Cedex, – France directeur du labo : Dr. Jean-Pierre Ozil,rra.fy.inj@uozoli
Présentation des laboratoires et remerciements Pour cette thèseles laboratoires d’accueilsont : INRA, Jouy en Josas, BDR, Labo Pulse- ions Responsable de laboratoire : Dr. Jean-Pierre OZIL Daniel HUNEAU Christian OUALI Dr. Bernadette BANREZES Eugenie CANON   Institut Jacques Monod, Responsable de laboratoire : Dr. Andras PALDI   Mezőgazdasági Biotechnolόgiai Központ (Centre de Biotechnologie d’Agriculture), Gödöllő, Laboratoire Biotechnologie Animale Responsable de laboratoire : Dr. BŐSZE Zsuzsanna  Remerciements exceptionnels á : Daniel Huneau et Iman Tóth-Ben Sliman  également à : Dr. Antoine KERJEAN Thomas HEAMS Dr. Takuya IMAMURA  Supportsde travail en France : Bourse du Gouvernement Français et Bourse de l’INRA Bourse bilaterale du Gouvernement Français et Hongrois (TET F-34/04)
Modulation of oocyte activation by artificial calcium regime initiates alterations in DNA methylation and in embryonic development in the mouse Abstract The discovery of the role of the chromatin reorganization in the nucleus transfer experiments redefined the concepts of the embryonic development regulation. It is surprising that, after its transfer
in an oocyte before activation, the complete epigenetic reprogramming of a somatic nucleus in mammalians is also possible. This reprogramming is produced only by the oocyte cytoplasm, it is carried out during oocyte activation and it lasts until implantation. However, there have been great difficulties in highlighting the correlations between oocyte activation, the early molecular modifications and later phenotypical changes. Working hypothesis: piloting of oocyte activation makes it possible to modify the epigenetic The reprogramming and the long-term development and also it helps to understand the processes behind the phenotypical changes.In the first approachof this project, we activated freshly ovulated mouse oocytes by various calcium signals induced by repetitive electropermeabilisations. The series of calcium regimes was assumed to highlight the role of the amplitude, duration and the frequency of the calcium signals in oocyte activation. The analysis of the methylation of the genes Igf2r and H19 in parthenogenetic embryos was used to evaluate the effects of calcium oscillations on epigenetic changes.In the second approachof the project we replaced the calcium signals of the fertilization, in vivo and in vitro, by artificially modulated signals. The aim was to study the long-term effects of the activation signals by the benefits of the zygotes’ developmental potential. (1) The thesis shows that oocyte activation can be controlled by the modulation of the cytoplasmic concentration of Ca2+ as well in fertilized oocytes as in non-fertilized ones. (2) We show alterations in the dynamics of chromatin reorganization and the existence of epigenetic changes dependent on activation. (3) Using a new method, which makes it possible to modulate the calcium signals of fertilization, this work shows remarkable differences on the level of the postimplantion development initiated by modification of the oocyte activation. (4) We also show that the majority of the developmental defects appear shortly after the implantation. (5) We established a system which, by the piloting of oocyte activation, makes it possible to modify the embryonic development in a reproducible way. This work offers a new platform for the molecular analysis in order to study the mechanism of the reprogramming process.  Key words: Oocyte activation, Epigenetic reprogrammation, Totipotency, Chromatin remodelling, Pronucleus reorganization, DNA methylation, Parthenogenesis, Fertilization, Embryonic development, Calcium, Microfluidic processor, Mouse
Résumé La découverte du rôle de la réorganisation globale de la chromatine dans les expériences de transfert de noyau a redéfini les concepts de la régulation du développement embryonnaire. Par ailleurs, il est surprenant de constater que la reprogrammation épigénétique d’un noyau somatique de mammifère est aussi possible après son transfert dans un ovocyte avant qu’il ne soit activé. Cette reprogrammation est produite uniquement par le cytoplasme de l’ovocyte et se réalise pendant et juste après l’activation ovocytaire. Cependant, il y a aujourd’hui de grandes difficultés à mettre en évidence les corrélations entre l’activation ovocytaire, les changements moléculaires précoces et les conséquences sur le développement. Hypothèse de travail : nouvelle possibilité de Le pilotage de l’activation ovocytaire peut offrir une modifier la ‘reprogrammation épigénétique’ et le développement à long terme et de comprendre ainsi les processus sous-jacents et leurs relations.Dans la première approche de ce projet, nous avons activé des ovocytes fraîchement ovulés de souris par différents signaux calciques induits par des électroperméabilisations répétitives. La série de régimes calciques a été conçue pour mettre en évidence le rôle de l’amplitude, la durée et la fréquence des signaux calciques dans l’activation ovocytaire. L’analyse de la méthylation des gènes Igf2r et H19 dans les embryons parthénogénétiques servira pour évaluer l’hypothèse que les oscillations calciques peuvent induire des altérations épigénétiques.Dans la deuxième approchedu projet, nous avons remplacé les signaux calciques de la fécondation (in vivoetin vitro) par des signaux modulés artificiellement, dans le but d’étudier les effets à long terme des signaux d’activation en profitant du potentiel de développement des zygotes. (1)La thèse démontre que l’activation ovocytaire peut être pilotée par la modulation de la
concentration cytosolique du Ca2+aussi bien dans les ovocytes fécondés que non fécondés.(2)Nous montrons l’altération de la dynamique de réorganisation de la chromatine et l’existence de changements épigénétiques dépendants de l’activation.(3) l’aide d’une nouvelle méthode qui A permet de moduler les signaux calciques de la fécondation, ce travail démontre des différences remarquables au niveau du développement postimplantatoire initiées par l’altération du régime d’activation.(4)  Nous semontrons également que la majorité des défauts de développement manifestent peu après l’implantation.(5)Nous avons établi un système qui permet (par le pilotage de l’activation ovocytaire) de modifier le développement embryonnaire d’une manière reproductible. Ce travail offre une nouvelle plateforme pour les analyses moléculaires afin d’étudier le mécanisme du processus de reprogrammation.  Mots clés : Activation Ovocytaire, Reprogrammation épigénétique, Réorganisation du noyau, Totipotence, Remodelage de chromatine, Méthylation de l’ADN, Parthénogenèse, Fécondation, Développement embryonnaire, Calcium, Processeur microfluidique, Souris
Table des matières Abrévations  6 I. Introduction  7 I. 1. Activation ovocytaire : le début de la vie 8 I. 1.1. Le régime calcique de la fécondation 9 I. 1.2. Activation artificielle et calcium 13 I. 2. Un événement énigmatique de la période de l'activation : la réorganisation de la chromatine  22 I. 2.1. La découverte de l’empreinte parentale 23 I. 2.2. Clonage et parthénogenèse réussies chez les mammifères 24 I. 2.3. Comment se réalise la réorganisation de la chromatine? 26 I. 2.4. Le marquage épigénétique pendant le cycle de la reproduction 29 I. 2.5. Les marquages épigénétiques et l’empreinte parentale 30 I. 2.6. Les événements nucléaires des premières heures du développement 32 I. 2.7. Les applications pratiques : parthénogenèse, FIV et clonage 34 I. 3. Stratégie de travail 35                             References 37  
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