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UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR STRASBOURG I

De
347 pages
Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR - STRASBOURG I THÈSE Présentée pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR Discipline : Chimie Organique Spécialité : Pharmacochimie par Sébastien GUERY CONCEPTION ET SYNTHESE DE DERIVES DE L'ARGININE : CONCEPTS ET VALIDATION SUR DES RECEPTEURS DE NEUROPEPTIDES Soutenue le 15 décembre 2003 devant la commission d'examen : Dr J. ZHU Rapporteur externe Dr E. POMBO-VILLAR Rapporteur externe Dr C. MIOSKOWSKI Rapporteur interne Pr M. HIBERT Examinateur Dr J.-J. BOURGUIGNON Directeur de thèse Dr M. SCHMITT Co-directeur de thèse

  • laboratoire de pharmacochimie de la communication cellulaire

  • tbdms tert-butyldiméthylsilyle

  • tert-butyle tcdi

  • synthese de derives de l'arginine

  • tbdps tert-butyldiphénylsilyle tbu

  • tfa acide trifluoroacétique

  • zhu rapporteur externe


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UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR - STRASBOURG I
THÈSE
Présentée pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR
Discipline : Chimie Organique
Spécialité : Pharmacochimie
par
Sébastien GUERY
CONCEPTION ET SYNTHESE DE DERIVES DE L’ARGININE :
CONCEPTS ET VALIDATION SUR DES RECEPTEURS DE
NEUROPEPTIDES
Soutenue le 15 décembre 2003 devant la commission d’examen :
Dr J. ZHU Rapporteur externe
Dr E. POMBO-VILLAR Reur externe
Dr C. MIOSKOWSKI Rapporteur interne
Pr M. HIBERT Examinateur
Dr J.-J. BOURGUIGNON Directeur de thèse
Dr M. SCHMITT Co-directeur de thèseREMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Pharmacochimie de la Communication
Cellulaire (Faculté de Pharmacie, Université Louis Pasteur – Strasbourg I) sous la direction
du Docteur Jean-Jacques Bourguignon, Directeur de Recherche au CNRS.
Je remercie tout particulièrement le Docteur Jean-Jacques Bourguignon pour m’avoir
accueilli au sein de son équipe et de m’avoir confié ce projet de thèse. Grâce aux nombreuses
discussions très enrichissantes que nous avons pu avoir au laboratoire (jusqu’à des heures
tardives parfois), il a su me guider et surtout me motiver durant ces trois années.
Je tiens à remercier le Docteur Martine Schmitt, Chargée de recherche au CNRS, pour
sa grande disponibilité, ses conseils et aussi son soutien dans les moments difficiles.
Je souhaite remercier le Docteur Jieping Zhu, Directeur de Recherche au CNRS à
l’ICSN, le Dr. Charles Mioskowski, Directeur de Recherche au CNRS à la faculté de
Pharmacie de Strasbourg et le Docteur Esteban Pombo-Villar de la société Novartis de Bâle,
de l’honneur qu’ils me font en acceptant de juger ce travail et de participer à la commission
d’examen.
Je tiens également à exprimer ma très profonde reconnaissance envers le Professeur
Marcel Hibert de m’avoir accepté au sein de son laboratoire et d’avoir accepter de juger ce
travail.
Je voudrais remercier également le Docteur Bernard Bucher et le Docteur Jean-Marie
Zajac pour avoir accepté de tester nos composés sur les récepteurs Y et sur les récepteurs du1
NPFF.
Mes remerciements sont également adressés aux chimistes qui ont su me passioner
pour cette discipline lors de mes études : le Pr. Camilles-Georges Wermuth et le Dr. Yveline
Rival pour leurs précieux conseils concernant mon orientation. Sans eux, je n’en serais
probablement pas là.
Je remercie chaleureusement toutes les personnes de l’UMR 7081 qui m’ont
accompagné pendant cette thèse : Benoît, Bruno, Cécile, Céline, Cyril, Dominique, Elodie,
Emmanuelle, Evelyne, Gilles, Jacques, Joao, Maryline, Nadia, Patricia, Patrick, Saïd, Romain,
Muriel, Jean-Lo, Christophe, Jérémie (que j’ai martyrisé avec des colonnes assez délicates), et
tous ceux que j’oublie…
Enfin, je n’oublie pas les personnes qui ont cru en moi pendant toutes ces années, je pense en
particulier à ma famille, à Marie et puis surtout à Adélaïde.A ma mèreLISTE DES ABREVIATIONS
4CC-SC 4 Component Condensation Segment
Coupling
4CC-SSSStereoselective
Segment Synthesis
Arom. Aromatique
Bn Benzyle
Boc Tert-Butyloxycarbonyle
BOP Benzotriazol-1-yloxy-tris(diméthylamino)-
phosphonium hexafluorophosphate
Bz Benzoyle
Cbz Benzyloxycarbonyle
CCM Chromatographie sur couche mince
CDI Carbonyle diimidazole
d Doublet
dd Doublet dédoublé
DCC Dicyclohexylcarbodiimide
DCM Dichlorométhane
DEAD Diéthylazodicarboxylate
DIEA Diisopropyléthylamine
DMAP 4-Diméthylaminopyridine
DMB 2,4-diméthoxybenzyle
DMF N,N-diméthylformamide
DMSO Diméthylsulfoxyde
Dns Dansyl
éq. Equivalent
Fmoc 9-Fluorénylméthoxycarbonyle
FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
GFP Green Fluorescent Protein
HOBt 1-Hydroxybenzotriazole
HPLC High Performance Liquid Chromatography
i.c.v. Intra-cérébro-ventriculaire
i.v. Intraveineux
m Multiplet
MS Mass Spectrometry
Ms Mésyle
NBDCl 4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole
NCA N-(carboxy)anhydride
nM nanomolaire
NMM N-méthylmorpholine
NPFF Neuropeptide FF
NPY Neuropeptide Y
pbf 2,2,4,6,7-pentaméthyldihydrobenzofuran-5-
sulfonyle
PCC Pyridinium chlorochromate
PDB Protein Data Bank
P Point de fusionf
Phtal. Phtalimide
pmc 2,2,5,7,8-pentaméthylchroman-6-sulfonyleq quadruplet
quint quintuplet
Rdt Rendement
R Rapport frontalf
RMN Résonance magnétique nucléaire
RSA Relation structure activité
s singulet
s.c. Sous-cutané
se singulet élargi
SNC Système nerveux central
ttriplet
TA Temérature Ambiante
TBAF Tétrabutyammonium fluoride
TBDMS Tert-Butydiméthylsilyle
TBDPS Tert-Butydiphénylsilyle
tBu Tert-buty
TCDI Thiocabonyle diimidazole
TEA Triéthylamine
TFA Acide trifluoroacétique
THF Tétrahydrofurane
TIS Triisopropylsilane
TMH Hélice transmembranaire
TMS Triméthylsilyle
t Temps de rétentionr
U-4C-5CR Réaction de Ugi à 4 composantes et à 5
centres réactifs
U-4CR Réaction de Ugi à 4 centres réactifs
VIP Vasoactive Intestinal Peptide
Acides aminés
Ala (A) Alanine Leu (L) Leucine
Arg (R) Arginine Met (M) Méthionine
Asn (N) Asparagine Lys (K) Lysine
Asp (D) Acide aspartique Phe (F) Phénylalanine
Cys (C) Cystéine Pro (P) Proline
Gln (Q) Glutamine Ser (S) Sérine
Glu (E) Acide glutamique Thr (T) Thréonine
Gly (G) Glycine Trp (W) Tryptophane
His (H) Histidine Tyr (Y) Tyrosine
Ile (I) Isoleucine Val (V) ValineRésumé
La découverte de neuropeptides comme molécules pharmacologiquement actives est
d’une importance considérable pour notre compréhension de la neurobiologie. Les
neuropeptides peuvent agir en tant que neurotransmetteurs, neuromodulateurs et en tant
qu’hormones. Ils contrôlent ou influencent de nombreux types de comportements
biologiques (par exemple le comportement sexuel, le comportement alimentaire, la
mémoire, l’apprentissage, la perception de la douleur, …). Certains de ces peptides
appartiennent à la famille des peptides de type RF-amide qui possèdent dans leur partie
C-terminale un résidu Arginine. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes
intéressés à deux peptides : le NPY (neuropeptide Y) et le NPFF (neuropeptide FF) qui
possèdent dans leur extrémité C-terminale ce motif RF-amide.
Dans un premier temps, notre travail s’est basé sur l’étude des relations structure-activité
d’un ligand qui se fixe sur les récepteurs Y du NPY et sur les récepteurs du NPFF : le1
BIBP 3226. Pour ce faire, nous avons dû mettre au point une méthode de synthèse
hautement convergente en solution et sur phase solide nous permettant d’obtenir avec de
très bons rendements et une excellente pureté des analogues et des dérivés d’arginine.
Les études de liaison spécifiques ont permis d’identifier deux composés tête de série :
LPI 211 (Ki = 0,10 µM sur NPFF et Ki = 0,16 µM sur NPFF ) et LPI 214 (comme1 2
antagoniste des récepteurs Y du NPY).1
D’autre part, nous avons également mis au point une méthode de synthèse de composés
fluorescents dérivés de l’arginine. Ces composés ont été évalués pour leur capacité à
produire du FRET (5 %) sur les récepteurs Y du NPY et ce en vue de mettre au point1
une nouvelle méthode de criblage à haut débit n’utilisant pas de composés radioactifs.
Enfin, nous nous sommes également intéressés à la synthèse de composés
hétérocycliques peptidomimétiques de type dihydrotriazinones par l’utilisation de la
réaction de Ugi. Cette voie de synthèse nous permet d’obtenir des dérivés substitués sur
l’azote N1 ou sur l’azote N4 en un nombre d’étapes limité.
Mots-clés : Neuropeptide FF-Neuropeptide Y-dérivés d’arginine-dihydrotriazinones-
phase solide-fluorescence-réaction de Ugi.Abstract
The discovery of neuropeptides as pharmacological active compounds is a breakthrough
for our understanding in neurobiology. Neuropeptides can act as neurotransmetters,
neuromodulators, and hormones. They control or influence a wide variety of biological
behaviours (sexual behaviour, food intake, memory, learning, pain perception, …). Some
of this peptides belong to the family of RF-amide peptides wich have in their C-terminal
part an arginine residue. In this work, we focused our interest on two peptides :
neuropeptide FF (NPFF) and neuropeptide Y (NPY). Both of them have in their C-
terminal part a RF-amide moiety.
On one hand, our work was based on the study of structure activity relationship of a non
specific ligand (BIBP 3226) which binds to both the NPY Y receptor and NPFF1
receptors. For this purpose, we had to optimize highly convergent synthetic methods both
in solution and in solid phase in order to synthesize with high yields and purity arginine
analogues and derivatives. Binding experiments highlighted two interesting hits : LPI
211 (Ki = 0,10 µM on NPFF and K = 0,16 µM on NPFF ) and LPI 214 (as antagonist of1 i 2
NPY on Y receptor).1
On the other hand, we have also performed an efficient method for the preparation of
fluorescent arginine derivatives. These compounds were tested for their ability to produce
FRET (5%) on Y receptors in order to create a new high throughput screening method.1
Finally, we developed an original preparation of heterocyclic peptidomimetic compounds
like dihydrotriazones by the use of Ugi four component reaction. This way of synthesis
allowed us to obtain N1 substituted or N4 substituted dihydrotriazinones with a limited
number of steps.
Keywords : Neuropeptide FF-Neuropeptide Y-Arginine derivatives-dihydrotriazinones-solid
phase-fluorescence-Ugi reactionTable des matières
1AVANT-PROPOS
11 Neuropeptides et système nerveux central
32 La guanidine : vers des interactions complexes
73 Objectifs des travaux

9CHAPITRE I : Synthèse de dérivés et d’analogues structuraux de
l’arginine : conception d’un ligand analogue au BIBP 3226 sélectif pour
les récepteurs du NPFF
91 Conception rationnelle de ligands des récepteurs du NPFF
1.1 Concept de « Message-Adresse » pour les ligands peptidiques endogènes 9
1.2 Identification des résidus responsables de la liaison au récepteur 11
1.3 Optimisation structurale et obtention d’un composé chef de file 13
131.4 Intérêts à la recherche de ligands des récepteurs au NPFF
1.4.1 Rappels bibliographiques 13
1.4.2 Découverte d’un composé tête de série : RF-2 15
1.4.3 Le BIBP 3226 : un antagoniste sélectif des récepteurs Y mais non 181
spécifique
1.5 Objectifs du projet pharmacochimique 22
222 Synthèse de dipeptides acylés par l’utilisation de N-
carboxyanhydrides (NCAs) :
2.1 Stratégie de synthèse envisagée 22
2.2 Préparation des N-carboxyanhydrides 25
2.3 Réactivité des NCAs avec un nucléophile 27
2.3.1 Rappels bibliographiques 27
2.3.2 Préparation de NCAs de la Nδ-Cbz ornithine 28
2.4 Bilan de l’utilisation des NCAs pour la synthèse de petits peptides 34353 Utilisation de la stratégie pmc pour l’obtention de dérivés d’arginine :
3.1 Synthèse du BIBP 3226 35
3.2 Synthèse du RF-9 39
414 Nouvelle stratégie de synthèse : utilisation de réactions multi-
composantes :
4.1 Rappels Bibliographiques 41
4.1.1 Mécanisme réactionnel et réactifs mis en jeu 41
4.1.2 Synthèse de peptides, peptoides et U-4CR stéréosélectives 42
a) Stratégies utilisées 42
b) Quelques exemples 44
4.2 Préparation des dérivés d’arginine 45
4.3 Préparation et utilisation du 4-(bis-tert-butoxycarbonylamino)butanal 47
pour l’obtention de dérivés d’ornithine
4.4 Préparation et utilisation d’un aldéhyde portant une fonction guanidine 48
4.4.1 Rappels sur la réactivité de la guanidine 49
a) Caractère basique et nucléophile 49
b) Electrophilie de la guanidine 50
4.4.2 Synthèse d’un aldéhyde guanidylé pour la construction d’arginine 51
52a) Utilisation d’une ω,ω’-(di-tert-butoxycarbonyl)guanidine
b) Utilisation d’une pmc-guanidine 55
c) Utilisation d’une tri-(tert-butoxycarbonyl)guanidine 56
d) Bilan sur les protections à adopter pour la guanidine 58
e) Combinaison d’un DMB et de deux groupements Boc 60
f) et d’un pmc : 624.4.3 Utilisation de l’aldéhyde guanidylé dans une U-4CR pour 64
l’obtention de dérivés d’arginine
64a) Synthèse en solution
b) Synthèse en phase solide 65
694.5 Utilisation d’isonitriles de phénylalanine
4.5.1 Isonitrile possédant un ester méthylique en partie C-terminale 70
4.5.2 Isonitrile possédant un amide en partie C-terminale 72
a) Utilisation d’un carboxamide non protégé 72
75b) Rappels bibliographiques sur les protections d’amides
c) Protection d’un carboxamide par un DMB 76
d) amide par un analogue du linker Rink 77
e) Protection d’un amide par deux groupements DMB 79
f) Protection d’un amide par un Boc et un DMB 80
825 Synthèse d’analogues d’arginine : guanidines modifiées et mimétiques
de guanidines
5.1 Utilisation du butan-1,4-diol pour l’introduction de diversité moléculaire 82
sur la guanidine en solution
855.2 l’introduction de diversité moléculaire
sur la guanidine sur support solide
88CHAPITRE II : Nouvelle voie d’accès à des amidines
hétérocycliques peptidomimétiques dérivés de
dihydrotriazinones par réactions multicomposantes.
881 Passage du peptide au peptidomimétique