UN I V E R S I T E LO U I S PA S T E U R –S T R A S B O U R G I

Claire Gasnier

Description

Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
UN I V E R S I T E LO U I S PA S T E U R –S T R A S B O U R G I U.F.R. des Sciences de la Vie et de la Terre THESE Présentée par Claire GASNIER En vue d'obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG Soutenue le 23 juin 2006 devant la commission d'examen : Mr Dominique AUNIS (Examinateur) Mme Marie-Hélène METZ-BOUTIGUE (Directeur de thèse) Mr Yves-Marie PIEMONT (Rapporteur interne) Mme Françoise SCHOENTGEN (Rapporteur externe) Mr Joël MAZURIER (Rapporteur externe) Mme Marie CHARVERON ((Examinateur) Nouvelles données sur les relations structure/fonction des chromogranines et leurs applications

• glandes surrenales


• systeme immunitaire


• nouvelles données sur les relations


• cellules chromaffines de la glande surrenale


• implication des cellules chromaffines


• role de l'immunite innee dans la stimulation des reponses immunitaires


• immunite naturelle


• relations entre le systeme nerveux

Sujets

• Piémont
• Berthe
• Grosch
• Goulven
• Étienne
• Gasnier

Informations

• Publié par: profil-zyak-2012
• Publié le: 01 juin 2006
• Nombre de lectures: 119
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 12 Mo

Extrait

U N I V E R S I T E L O U I S P A S T E U R – S T R A S B O U R G I

U.F.R. des Sciences de la Vie et de la Terre

THESE

Présentée par C l a i r e G A S N I E R

En vue d’obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE LOUIS PASTEUR DE STRASBOURG

Nouvelles données sur les relations structure/fonction

des chromogranines et leurs applications

Soutenue le23 juin 2006devant la commission d’examen : Mr Dominique AUNIS(Examinateur) Mme Marie-Hélène METZ-BOUTIGUE(Directeur de thèse) Mr Yves-Marie PIEMONT(Rapporteur interne) Mme Françoise SCHOENTGEN(Rapporteur externe) Mr Joël MAZURIER(Rapporteur externe) Mme Marie CHARVERON((Examinateur)

A Térence et à Philippe

La subtilité humaine ne concevra jamais une invention plus belle, plus simple ou plus juste que la nature car dans ses inventions rien ne manque, et rien n’est superflu.

Leonardo da Vinci (Peintre, sculpteur, ingénieur, architecte et savant, 1452-1519)

Merci !

Ce travail a été effectué dans l’unité Inserm 575, Physiopathologie du système nerveux. Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au DrDominique Aunis, directeur de recherche à l’Inserm et directeur de l’U575, pour m’avoir accueillie dans son unité et m’avoir donné l’opportunité de réaliser mes recherches dans des conditions très favorables. Je dois un grand remerciement au DrMarie-Hélène Metz-Boutiguem’avoir pour accueillie dans son équipe comme ingénieure, et m’avoir permis cependant de réaliser ce travail de thèse. Merci pour sa confiance, son soutien, sa compréhension et ses encouragements. Merci encore pour ses conseils scientifiques avisés, ainsi que pour son intérêt dans mes recherches. Je tiens à adresser mes plus vifs remerciements au ProfesseurYves-Marie Piemont, ainsi qu’aux docteursFrançoise Schoentgen,Marie Charveron,Joël Mazurieravoir pour chaleureusement accepté de juger ce travail, et pris la peine de lire ce manuscrit. Je remercie également les docteursJean-Claude Voegel,Christophe Egles et Olivier Etienne de l’U595 pour m’avoir permis de collaborer avec succès à un projet enrichissant et prometteur. Ma reconnaissance va au PrYoussef Haikel, doyen de la faculté d’odontologie, qui m’a soutenu financièrement cette année. Je remercie particulièrementJean-Marc Strub pour son aide en spectrométrie de masse, etSylvie Grosch pour son expertise en microscopie confocale. Un grand merci à Corinne Taddéi(une autre grande amatrice de thé) pour la relecture attentive et critique de ce manuscrit. Je remercie tous mes collègues de laboratoire, passés et présents, cette thèse n’aurait pas été un plaisir sans quelques personnes formidables :Yannick Goumon, ton aide et tes conseils me seront utiles encore longtemps. Pour ce que tu m’as donné, reçois ici mon amitié, mon respect, et ma profonde reconnaissance. Il n’y a pas de travail sans plaisir ; la joie, la bonne humeur et l’humour, sont autant d’atouts qui contribuent au bon déroulement d’une thèse, pour tout cela je tiens à adresser mes plus vifs remerciements àElise(notre grande sœur à tous),Patricia(surtout ne change rien, mais avec une double dose de chocolat),Dan(merci pour l’enrichissement culturel),Martine S.bien précieusement tes amitiés (conserve pâtissières…),Aziza(bon courage avec les parasites),Peimantu es beau  (que !),Arnaud (Président du Comité d’Extermination par Phagocytose des Crayons Innocents),Bernard (désolée, je ne m’appelle toujours pas Hélène),François(désolée que nous n’ayons pas eu le temps de faire plus ample connaissance), qui ont su avec beaucoup de stoïcisme supporter et peut-être parfois apprécier (?) mes blagues et mes jeux de mots (Elise, je compte sur toi pour reprendre dignement le flambeau !). Tous les stagiaires qui m’ont croisée pendant ces 5 années, et plus particulièrement Véronique Piel,Céline Trometer, etNathalie Tien-Mi-Tiee, 3 stagiaires que j’ai pu encadrer avec plaisir, mais aussiPerrine,Aurélia,Mélanie,Priscille,Thierry,Julien,Abdeslam, Stéphaneet tous les autres, merci à tous les étudiants qui sont passés dans le laboratoire, pour

les bons moments que nous avons partagés, j’ai plus appris grâce à vous que je ne vous ai appris… Je n’oublie pas ceux qui sont déjà partis vers des contrées plus lointaines (c’est-à-dire plus loin que l’Esplanade) :Jenny, ma voisine de paillasse pendant 3 ans, merci de ta spontanéité, de ta simplicité et de ta sincérité, je te souhaite un avenir riche et créatif,Amaret Jean-Eric, souriants et drôles, soyez de gentils papas,Gérard Nullans, merci de tes qualités humaines, profite pleinement de ta retraite. Aux personnes croisées au détour d’un couloir (ou dans la pièce 3401), un sourire, quelques mots, ou blagues, merci pour cela,Delphine,Stella,Laetitia,MartineR,Olivier, Patrice,Jean-Paul… Merci à toutes les personnes de l’unité qui ont, grâce à leurs conseils, contribué à l’avancement de mes travaux de thèse. La thèse est avant tout une expérience humaine où se succèdent certitudes et désillusions, enthousiasme et découragement. Je voudrais exprimer toute ma gratitude à celles qui ont contribué à me remonter le moral durant cette thèse, qu’elles soient depuis peu docteur, ou en passe de l’être,Isabelle,Céline M, etCéline S, je vous remercie pour ces 5 années d’amitié. Vous avez été là quand j’en ai eu besoin, c’est beaucoup, pour cela je vous dis un grand merci. Et parce qu’il y a une vie hors du labo, je tiens à remercier tous ceux qui m’ont encouragée et réconfortée dans les moments difficiles :Sara Hardy, Louis Calaferte, Emmanuel Decelle, Priscilla Decelle, Terry Pratchett, Céline Buyse, Marie Gaumé, JK Rowling, Jérome Rageot, Fabrice Goulven, Vincent Rinche, Didier van Cauwelaert, Marlène Cot, Céline Théron, Christelle Gabaston, Emeline Fabre, Douglas Adams, Johanna Gourmaud, Delphine Théard… Je tiens à remercier mes parents qui ont toujours veillé de près, malgré la distance, à mon bien-être avec une confiance sans borne.Sylvie, maman, grâce à toi maintenant je suis une grande fille, mais la petite fille qui demeure en moi aura toujours besoin de toi.Gérard, papa, tu as su me faire grandir dans l’amour de la science, merci.Vincent, qu’il est bon de te connaître mon frère. Mes grands parents,RenéetSimone, qui m’ont toujours soutenu, et ont fait les frais de mes premières expériences scientifiques. MamieBerthe, là haut j’espère que tu es heureuse, merci pour tout ce que tu as été. Et enfin, à ceux qui sont jour après jour à mes côtés, me soutiennent, me supportent, me connaissent par cœur. Pendant toutes ces années, j’ai toujours pu compter sur un soutien indéfectible, riche en amour. MerciPhilippe, parce que c’est toi.Térence, merci mon bébé, j’ai du mal à croire que tu sois déjà si grand, tu es ma joie, merci d’être. Merci simplement parce que vous êtes là. Les mots ici ne diront pas tout. Merci de tout mon cœur.

SOMMAIRE

ABREVIATIONS

FIGURES

TABLEAUX

INTRODUCTION

Sommaire

Données bibliographiques

Sommaire

CHAPITRE I : LES CELLULES CHROMAFFINES DE LA GLANDE SURRENALE :

NOTRE MODELE D’ETUDE

I-L ES GLANDES SURRENALES

II-L ES CELLULES CHROMAFFINES

III-L ES GRANULES DE SECRETION

IV-I MPLICATION DES CELLULES CHROMAFFINES LORS DES ETATS DE STRESS

CHAPITRE II : RELATIONS ENTRE SYSTEME NERVEUX ET SYSTEME

IMMUNITAIRE

a

h

l

o

- 1 -

- 5 -

-5- -7- -9- -11-

- 13 -

I-L ES FACTEURS DE L ’ IMMUNITE  -13- 1-I NTRODUCTION  -13- 2-L’ IMMUNITE ADAPTATIVE  -14- 3-L’ IMMUNITE NATURELLE OU INNEE  -17- 9Effecteurs mis en jeu - 18 - 4-R OLE DE L ’ IMMUNITE INNEE DANS LA STIMULATION DES REPONSES IMMUNITAIRES ADAPTATIVES - 20- II-R ELATIONS ENTRE LE SYSTEME NERVEUX ET LE SYSTEME IMMUNITAIRE INNE  -22- 1-I NTRODUCTION  -22- 2-L ES LIENS ENTRE LE SNC ET L ’ IMMUNITE  -22-

- a -

3-C ONTROLE DU SNS SUR L ’ IMMUNITE

9Effets du Neuropeptide Y sur les cellules immunitaires

4-E FFETS DES FACTEURS DE LA SURRENALE SUR L ' IMMUNITE

a- L’axe HHS : agent de la régulation de la réponse immunitaire

b- Rôle de la médullo-surrénale sur l’immunité

5-C ONCLUSION

CHAPITRE III : LES PEPTIDES ANTIMICROBIENS (PAMS)

I-I NTRODUCTION II-L ES PEPTIDES ANTIMICROBIENS CATIONIQUES 1-P EPTIDES LINEAIRES EN HELICE α AMPHIPATHIQUE 2-L ES PEPTIDES LINEAIRES RICHES EN PROLINE 3-L ES PEPTIDES ORGANISES EN FEUILLET β

Sommaire

-24- - 26 - -26- - 26 - - 27 - -28-

- 30 -

-30- -30- -31- -32- -33- III-A CTION DES PEPTIDES ANTIMICROBIENS DANS LE CADRE DE LA REPONSE IMMUNITAIRE  -34- -34- -34- -35- -36- -37- -38- -39- -40- -41- -41- -42- -42- -43- -44- -44- -44- -45- -45- -45- -46- -47- -49-

1-I NTRODUCTION 2-I MPLICATION DES PAM S CATIONIQUES DANS L ’ IMMUNITE 3-P EPTIDES EXPRIMES CONJOINTEMENT AVEC DES ELEMENTS DU SYSTEME IMMUNITAIRE 4-R OLES PHYSIOPATHOLOGIQUES DES PAM S 5-A CTION DIRECTE DES PAM S SUR LES PATHOGENES 6-M ODULATION DU SYSTEME IMMUNITAIRE PAR LES PAM S 7-A CTIVATION DU SYSTEME IMMUNITAIRE PAR LES PAM S 8-S UPPRESSION DE L ’ INFLAMMATION MEDIEE PAR LES PAM S 9-L ES PAM S COMME ADJUVANTS DANS L ’ IMMUNITE 10-M ECANISME DE LA MODULATION DE L ’ IMMUNITE PAR LES PAM S 11-C ONCLUSION IV-M ODES D ’ ACTION DIRECT DES PEPTIDES ANTIMICROBIENS 1-L E MODELE BARREL - STAVE 2-L E MODELE CARPET - LIKE 3-L E MODELE TOROÏDAL OU WORMHOLE 4-A UTRES MODES D ’ ACTION DES PEPTIDES ANTIMICROBIENS V-A PPLICATIONS THERAPEUTIQUES DES PEPTIDES ANTIMICROBIENS 1-I NTRODUCTION 2-R OLE DES PAM S CONTRE LES PATHOGENES 3-R OLE CONTRACEPTIF ET ANTITUMORAL 4-U NE VOIE POSSIBLE D ’ ADMINISTRATION DES PAM S VI-C ONCLUSION

- b -

CHAPITRE IV : LES CHROMOGRANINES / SECRETOGRANINES

I-L A FAMILLE DES GRANINES

II-L OCALISATION DES CHROMOGRANINES

III-M ODIFICATIONS POST - TRADUCTIONNELLES DES CHROMOGRANINES

IV-F ONCTIONS BIOLOGIQUES DES CHROMOGRANINES

V-L A CHROMOGRANINE A ET LA CHROMOGRANINE B

1-S TRUCTURE PRIMAIRE DES CHROMOGRANINES

a- La CGA b- La CGB 2-L ES PEPTIDES DERIVES DES CHROMOGRANINES a- La CGA 9Les vasostatines I et II

9La Prochromacine et La Chromacine

9La chromostatine

9La pancréastatine 9Le WE-14 9La catestatine

9La parastatine

9Protéolyse de la chromogranine A par la PC2 b- La CGB 9Le GAWK

9Le BAM -1745

9Le CCB (C-terminal Chromogranin B derived peptide)

9La Sécrétolytine

3-L OCALISATION DES CHROMOGRANINES

4-I MPLICATION DES CHROMOGRANINES DANS LES DESORDRES NEURODEGENERATIFS a- La CGA 9La maladie de Parkinson

9La sclérose latérale amyotrophique

9La schizophrénie

9La maladie d’Alzheimer

9Activation des cellules microgliales b- La CGB 9La schizophrénie

9La maladie de Creutzfeld-Jakob

Sommaire

5-U TILISATION DES CHROMOGRANINES COMME MARQUEUR DE TUMEURS NEUROENDOCRINES

- c -

- 50 -

-50- -50- -52- -53- -53- -54- - 54 - - 58 - -60- - 60 - - 61 - - 62 - - 62 - - 63 - - 63 - - 63 - - 64 - - 65 - - 65 - - 66 - - 66 - - 66 - - 67 - -67- -68- - 68 - - 69 - - 69 -

- 69 - - 69 - - 70 - - 70 - - 70 - - 70 - -71-

a- La CGA b- La CGB 6-F ONCTION BIOLOGIQUE DES CHROMOGRANINES a- La CGA 9Interaction CGA-SgIII 9Interaction de la CGA sur le récepteur de l’IP3

9Rôle dans les mécanismes de sécrétion 9Rôle de la CGA dans la circulation b- La CGB 9Implication dans les phénomènes de sécrétion 9Rôle potentiel dans la transcription VI-L A SECRETOGRANINE II

1-S YNTHESE ET EXPRESSION DE LA S G II 2-S TRUCTURE PRIMAIRE ET MATURATION PROTEOLYTIQUE 3-L ES PEPTIDES ISSUS DE LA MATURATION DE LA S G II a- La sécrétoneurine b- Le peptide EM-66 c- La mansérine

d- Le peptide AMENM

VII-C ONCLUSION

Résultats expérimentaux

Sommaire

- 71 - - 72 - -72- - 72 - - 72 - - 72 - - 73 - - 74 - - 75 - - 75 - - 75 - -77- -77- -78- -81- - 81 - - 82 - - 83 - - 83 - -84-

CHAPITRE I : ANALYSE DES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES DE LA CHROMOGRANINE B PRESENTE DANS LES GRANULES DE SECRETION DES CELLULES CHROMAFFINES BOVINES - 85 -

I-C ONTEXTE DE L ’ ETUDE II-R ESULTATS ACQUIS AVANT MON ETUDE III-P RINCIPAUX RESULTATS 1-P UBLICATION 1 2-S TRATEGIE EXPERIMENTALE a- Electrophorèse bidimensionnelle b- Digestion de la CGB par l’endoprotéase Lys-C : analyse des fragments c- Analyse du fragment naturel CGB 1-192 d- Analyse du fragment naturel CGB 564-626 IV-D ISCUSSION -C ONCLUSIONS

- d -

-85- -86- -88- -88- -88- - 88 - - 89 - - 89 - - 89 - -90-

a- Les phosphorylations

b- Les glycosylations

c- Les sulfatations

d- Les oxydations

e- Le polymorphisme M/V

f- Conclusion

V-P ERSPECTIVES

Sommaire

- 90 - - 90 - - 91 - - 91 - - 91 - - 92 - -93-

CHAPITRE II : ANALYSE PROTEOMIQUE DE LA MATURATION PROTEOLYTIQUE DE LA SECRETOGRANINE II CONTENUE DANS LES GRANULES DE SECRETION DES CELLULES CHROMAFFINES DE LA MEDULLO-SURRENALE BOVINE - 107 -

I-I NTRODUCTION

II-S TRATEGIE EXPERIMENTALE

III-R ESULTATS

1-C ARTOGRAPHIE DES FRAGMENTS DERIVES DE LA S G II

a- Electrophorèse bidimensionnelle

b- Identification des différents fragments dérivés de la Sg II

2-R ECHERCHE ET LOCALISATION DES MODIFICATIONS POST - TRADUCTIONNELLES

IV-C ONCLUSION

-107- -109- -110- -110- - 110 - - 114 - -115- -119-

CHAPITRE III : MISE EN EVIDENCE DE L’EXISTENCE DE PEPTIDES A ACTIVITES ANTIMICROBIENNES ET ANTIFONGIQUES DERIVES DE LA SECRETOGRANINE II - 121 -

I-I NTRODUCTION

II-S TRATEGIE EXPERIMENTALE

III-R ESULTATS

1-R ECHERCHE DE PEPTIDES ANTIMICROBIENS NATURELS

-121- -121- -122- -122-

2-A NALYSE DE L ’ ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DE LA SECRETONEURINE ET DU PEPTIDE AMENM -122- 3-A NALYSE DE LA SEQUENCE DE LA S G II BOVINE  -122- 4-A CTIVITES ANTIMICROBIENNES DES PEPTIDES SYNTHETIQUES (A-D) -126-

5-A NALYSE DE L ’ INTERACTION DES PEPTIDES A E ET C E AVEC LE CHAMPIGNON FILAMENTEUX

N EUROSPORA CRASSA  -129- 6-R ECHERCHE DE SIMILARITE DES PEPTIDES RETENUS AVEC DES PEPTIDES ANTIMICROBIENS CONNUS  -129-

- e -

IV-C ONCLUSION ET PERSPECTIVES

Sommaire

CHAPITRE IV : INSERTION D’UN PEPTIDE ANTIMICROBIEN DERIVE DE LA

CHROMOGRANINE A DANS UNE NANOSTRUCTURE

I-C ONTEXTE DE L ’ ETUDE

II-P RINCIPAUX RESULTATS

1-P UBLICATION 2

2-S TRATEGIE EXPERIMENTALE

a- Construction des films de polyélectrolytes

b- Insertion de la chromofungine

c- Tests d’activité antifongique

d- Microscopie confocale

e- Tests de cytotoxicité

f- Etude in vivo

III-C ONCLUSION ET PERSPECTIVES

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

MATERIELS ET METHODES

-132-

- 134 -

-134- -134- -134- -135- - 135 - - 135 - - 135 - - 136 - - 136 - - 136 - -137-

- 147 -

- 150 -

I-P REPARATION DU MATERIEL BIOLOGIQUE  -150- 1-P URIFICATION DES PROTEINES SOLUBLES DE LA MATRICE INTRAGRANULAIRE DES CELLULES CHROMAFFINES  -150- II-D OSAGE PROTEIQUE  -151- III-S YNTHESE PEPTIDIQUE  -151- IV-M ETHODES DE PURIFICATION DES ECHANTILLONS BIOLOGIQUES  -152- 1-P REPARATION DE L ’ ECHANTILLON  -152- 2-C HROMATOGRAPHIE HPLC DE PHASE INVERSE  -153- a- Préparation de la phase mobile - 153 - b- Séparation - 153 - 3-C HROMATOGRAPHIE D ’ EXCLUSION  -154- 4-C HROMATOGRAPHIE D ’ AFFINITE  -154- a- Purification d’anticorps polyclonaux à partir de sérum de lapin - 154 - b- Fixation des anticorps sur la colonne d’affinité - 155 - c- Purification de l’échantillon - 155 - 5-D ESSALAGE DES ECHANTILLONS  -155-

- f -