Approches thérapeutiques pour le traitement des dysferlinopathies, Therapeutical approaches for dysferlinopathies treatment

William Lostal

Description

Sous la direction de Isabelle Richard
Thèse soutenue le 09 juillet 2010: Evry-Val d'Essonne
Ce travail de thèse a porté sur le développement d'approches thérapeutiques pour les dysferlinopathies, pathologies dues à un déficit en dysferline, pour lesquelle sil n'existe pas de traitement à l'heure actuelle. Nous avons généré et caractérisé un modèle murin déficient en dysferline, B6.A/J-Dysfprmd, pouvant être comparé avec une souche contrôle. Ce modèle présente une atteinte dystrophique dès deux mois et une diminution de l'activité locomotrice est mise en évidence. Dans une approche par transfert de gène dans le muscle, compte-tenu de la taille de l’ADNc de la dysferline, nous avons utilisé la capacité à se concatémériser des vecteurs AAV. Les résultats ont montré une expression stable d’une protéine entière, jusqu’ à au moins un an. Cette expression est associée à une amélioration fonctionnelle et phénotypique des animaux traités. Une autre étude a porté sur l’évaluation du potentiel thérapeutique d’une forme courte de dysferline. Les résultats ont montré qu’une protéine tronquée était exprimée et permet une restauration partielle de la fonction de réparation membranaire, mais aucune amélioration phénotypique n’est détectée. Ces résultats suggèrent pour la première fois, une modularité de la dysferline. Finalement, nous avons testé si un déficit en dysferline pouvait être compensé par la surexpression de myoferline. Un modèle murin surexprimant la myoferline a été créé. Celui-ci ne montre pas de signes délétères dus à cette surexpression. Ces souris transgéniques ont ensuite été croisées avec les souris déficientes en dysferline. Une amélioration de la fonction de réparation membranaire est observée, mais le phénotype dystrophique du muscle n’est pas amélioré.
-Aav
In this work, I developed and studied therapeutical strategies for dysferlinopathies, neuromuscular disorders due to dysferlin deficiency. To date, no treatment is available for these diseases. We generated and characterized a dysferlin deficient mouse model, B6.A/J-Dysfprmd. The onset begins at 2-month old with an associated decrease of locomotor activity. For gene transfer approach into muscle, dysferlin coding sequence is too large to enter into a single rAAV. We used properties of rAAV to concatemerize by ITR sequences interaction. Results, obtained with this strategy, showed expression of entire dysferline protein until at least one year. We showed also that this expression is associated to an improvement of phenotype and functional activity of tretaed mice. We also studied therapeutical potential of a truncated dysferlin protein. Results showed the expression of a short protein cassociated to a partial functional membrane repair activity, but none in locomotor activity. Nonetheless, these results showed for the first time a partial modularity of dysferlin. Finally, we also studied compensation of dysferlin by myoferlin overexpression in muscle. A myoferlin-overexpressing transgenic mouse model was generated; a significant level of myoferlin is detected but no deleterious effect was observed. These transgenic mice were crossed with dysferlin deficient mice. An improvement of membrane repair capacity is observed, nevertheless, dystrophic features into muscle were still present.
Source: http://www.theses.fr/2010EVRY0009/document

Informations

• Publié par: Thesee
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• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

|Remerciements
Remerciements
Merci…
Je voudrais exprimer toute ma gratitude aux personnes qui ont permis l’aboutissement de ce
travail.
Je tiens à remercier en premier lieu le Docteur Isabelle Richard pour m’avoir accueilli au sein de
son équipe à Généthon et de m’avoir permis de réaliser cette thèse. Je la remercie pour la
confiance qu’elle m’a témoigné, ses nombreux conseils et discussions brigués au long de ces
années, et la grande autonomie d’expression et d’action qu’elle m’a donné.
Je remercie également les membres du jury pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de prendre
part à ce travail. Mes sincères remerciements vont à Francis Quétier pour en avoir accepté la
présidence, et qui quelque part est responsable du parcours universitaire que j’ai réalisé. Je tiens
à exprimer ma gratitude aux Docteurs François-Jérôme Authier et Anna Salvetti pour l’intérêt
qu’ils ont portés à ce travail de thèse et pour avoir accepté si promptement de participer au jury
en qualité de rapporteurs . Je remercie également le Docteur Anna Buj-Bello d’avoir accepté
d’examiner mon travail de thèse.
Je tiens ensuite à remercier Marc Bartoli, pour son encadrement de la première heure ; il est en
quelque sorte mon modèle de chercheur ; ses précieux conseils, son soutien et ses connaissances
qu’il a partagé avec moi.
J’adresse également mes remerciements les plus chaleureux à tous les membres de l’équipe
«Dystrophies des Ceintures » qui ont tous contribué à l’aboutissement de ce travail et qui m’ont
permis d’évoluer dans une ambiance conviviale. Un grand merci à Nathalie Bourg-Alibert qui m’a
accompagné et supporté tout au long du projet dysferline. Un merci des plus sincères à Carinne
Roudaut, Sylvie Marchand et Laurence Suel-Pétat qui sont en quelques sortes responsables de ma
formation technique à bien des niveaux. Merci à Evelyne Gicquel et Jérôme Poupiot, qui ont été
les premiers à devoir me supporter en tant que colocataire, pour leur enthousiasme, pour avoir
été à l’écoute dans les moments de doute et pour leur amitié sincère. Merci aussi à
Marina Pryadkina, Marie André, Luu Nguyen, Florence LeRoy, Nathalie Danièle et Rapfaël De Cid
Ibeas, sans oublier François Monjaret, Shabahang-Soheili Tayebeh, alias « Shabi » qui sont les
prochains sur la liste des thésards et à qui je souhaite bon courage.
Un merci tout particulier à Karine Charton, mon binôme de thèse. Ensemble nous avons pu
partager nos périodes de doutes, de craintes, de joies et qui a été d’un grand soutien, j’espère
réciproque, durant ces années de thèse.
Je voudrais remercier également, ceux qui ont transité par l’équipe DDC : Lydie Laure, Laëtitia
Barrault, Astrid Milic, Azeddine Bentaïb, Jean-Baptiste Boucheteil, Fanny Noulet, Stéphanie
Duguez, Delphine Bonnin, Martin Krahn, Gaëlle Blandin, Jennifer Butler et Loraine Heyman.
Je remercie également pour leur sollicitation tant intellectuelle qu’amicale Martine Barkats et
Daniel Stockholm. Merci pour leur aide, leurs conseils, suggestions et encouragements dans
l’élaboration de ce travail.
- 1 - |Remerciements
Je tiens à remercier tous les membres de l’animalerie, de l’expérimentation animale et du service
d’histologie pour leur disponibilité à tout instant, ainsi que des services de séquençage, de
production de vecteurs, de l’imagerie et de l’informatique.
Un grand merci à la grande famille qu’est le téléthon. A travers ces 5 téléthons passés au cœur
de l’action, je garde le souvenir de grand moment de bonheur, de fatigue mais surtout de grands
moments fédérateurs qui rappellent plus que jamais la raison de notre travail. Une pensée à la
Gap-team et à son leader Fabrice Maréchal, avec qui a débuté (et terminé) ma carrière d’acteur.
Dans cette grande famille, je souhaite remercier du plus profond de mon cœur ceux qui sont
devenus mes amis. Merci pour leur soutien, leur compagnie et leur sympathie. Merci à Karine,
Lydie, Jéjé, Evy, Laëtitia, Astrid, Shabi, Fifi, Sév, Tibo, Nico, Ludo, JB, Stef, Fatima, Romain,
Karim, Lionel et Marc, ainsi que ceux rencontrés par leur intermédiaire : Xavier, Eve, Milad,
Marianne, Audrey, Estelle, Amandine…
Enfin tout ce travail n’aurait pu voir le jour sans les encouragements, l’aide et le soutien
inconditionnel de ma famille et mes fidèles amis. Merci de m’avoir accompagné, soutenu et essayé
de comprendre mes travaux. Un immense merci à Maman, Sonia, Laura, mon père, Jacqueline et
Jorges, ma cousine Mélanie, mes grands-parents, Seboo et Kwet, Ninisse, Alex, Gallou, Aurélie,
Nonore et Gautier, Tator et Karele, Vinie, Did, Julik , Sylvain et Caro.
Merci pour votre confiance, votre gentillesse et votre compréhension
- 2 - |Résumé
RESUME
Ce travail de thèse a porté sur le développement d'approches thérapeutiques pour les
dysferlinopathies, pathologies dues à un déficit en dysferline. A l'heure actuelle, il n'existe pas de
traitement pour ces maladies. Ces stratégies, évaluées sur un modèle murin déficient en dysferline,
se basent sur des approches originales de : transfert de gène par concatémérisation de rAAV, de
transfert de mini-gène ou de compensation par surexpression protéique.
Dans un premier temps, nous avons généré et caractérisé un modèle murin déficient en dysferline,
PRMDB6.A/J-DYSF , pouvant être comparé avec une souche contrôle. Les premiers signes
dystrophiques apparaissent dès l‟âge de deux mois et sont associés à une activité locomotrice
réduite, ainsi qu'un mécanisme inactif de réparation membranaire par rapport aux souris contrôles.
Dans une approche par transfert de gène dans le muscle, compte-tenu de la taille de l‟ADNc de la
dysferline (>6kb), nous avons utilisé les propriétés des AAV à se concatémériser entre eux par
leurs séquences ITR. Pour cela, nous avons réparti le messager de la dysferline humaine en deux
cassettes d‟expression. Les résultats ont montré que cette approche permet l‟expression stable
d‟une protéine entière, jusqu‟ à au moins un an après une injection intramusculaire. Cette
expression protéique est associée à une localisation normale de la dysferline dans la fibre
musculaire et montre une restauration fonctionnelle, par une récupération de la fonction de
réparation membranaire, ainsi que d‟une amélioration de l‟activité locomotrice des animaux traités
après administration systémique des vecteurs.
Une autre étude a porté sur l‟évaluation du potentiel thérapeutique d‟une forme courte de
dysferline, suite à l‟identification d‟une large délétion chez une patiente au phénotype modéré. Les
résultats ont montré qu‟une protéine de 73 kDa était exprimée et se localisait dans les mêmes
compartiments cellulaires que la protéine endogène. Nous avons montré qu‟une restauration
partielle de la fonction de réparation membranaire était obtenue, mais qu‟aucune amélioration de
l‟activité locomotrice n‟était détectée, suggérant l‟implication nécessaire de domaines
supplémentaires. Ces résultats suggèrent pour la première fois, une modularité de la dysferline.
Finalement, nous avons testé si un déficit en dysferline pouvait être compensé par la surexpression
de myoferline. Cette protéine appartient à la même famille que la dysferline avec laquelle elle
partage de nombreuses similarités. Nous avons pour cela créé un modèle murin surexprimant la
myoferline. Celui-ci ne montre pas de signes délétères dus à cette surexpression. Ces souris
PRMDtransgéniques ont ensuite été croisées avec les souris déficientes en dysferline, B6.A/J-DYSF .
Une amélioration de la fonction de réparation membranaire est observée, mais le phénotype
dystrophique du muscle n‟est cependant pas amélioré.
- 3 -
- 4 - |Summary
SUMMARY
In this work, I developed and studied therapeutical strategies for dysferlinopathies, neuromuscular
disorders due to dysferlin deficiency. To date, no treatment is available for these diseases. These
strategies were evaluated on dysferlin deficient mouse model created in our laboratory. Many
original approaches of gene transfer by rAAV such as concatemerization and gene transfer of a
minigene, together with compensation by protein overexpression were tested.
PRMDFirst, we generated and characterized a dy