Biochemical, structural and functional characterization of diheme-containing quinol:fumarate reductases [Elektronische Ressource] : the role of heme propionates and the enzymes from pathogenic {_e63-proteobacteria / von Mauro Mileni

Mauro Bassignana

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• Biologie

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• Publié par: goethe_universitat_frankfurt_am_main
• Publié le: 01 janvier 2005
• Nombre de lectures: 19
• Langue: English
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Extrait

Biochemical, Structural and Functional
Characterization of Diheme-Containing
Quinol:Fumarate Reductases:
the Role of Heme Propionates and
the Enzymes from Pathogenic ε-Proteobacteria




Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften




Vorgelegt beim Fachbereich 14
Chemische und Pharmazeutische Wissenschaften
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main



von
Mauro Mileni
aus Corridonia (Italien)


Frankfurt am Main, 2005
(DF1)












vom Fachbereich Chemische und Pharmazeutische Wissenschaften der Johann
Wolfgang Goethe-Universität als Dissertation angenommen.









Dekan: Prof. Dr. Harald Schwalbe
1. Gutachter: Prof. Dr. Bernd Ludwig
2. Gutachter: PD Dr. C. Roy D. Lancaster
Datum der Disputation: 1. August 2005

ii
Manuscripts to be published:


Mauro Mileni, Fraser MacMillan, Christos Tziatzios, Klaus Zwicker, Alexander H. Haas,
Werner Mäntele, Jörg Simon, and C. Roy D. Lancaster. (2005) Heterologous production in
Wolinella succinogenes and characterization of the quinol:fumarate reductases from
Helicobacter pylori and Campylobacter jejuni. Manuscript submitted.

Mauro Mileni, Alexander H. Haas, Werner Mäntele, Jörg Simon, and C. Roy D. Lancaster.
(2005) Probing heme propionate involvement in transmembrane proton transfer coupled to
13electron transfer in dihemic quinol:fumarate reductase by C-labeling and FTIR difference
spectroscopy. Manuscript submitted.

Mauro Mileni & C. Roy D. Lancaster. The 3D-crystal structure of the quinol:fumarate
reductase from the pathogenic ε-proteobacterium C. jejuni. Manuscript in preparation.

Mauro Mileni, Fraser MacMillan, C. Roy D. Lancaster. Quinol:fumarate reductases from ε-
proteobacteria, new mechanistic insights from biophysical data. Manuscript in preparation.


iii
Ausführliche deutschprachige Zusammenfassung

Die Chinol:Fumarat Reduktase (QFR) ist die terminale Reduktase der anaeroben Fumarat-
Atmung, welche die häufigste Art der anaeroben Atmung darstellt. Dieser Membranprotein-
komplex koppelt die Oxidation von Menachinon zu Menachinol an die Reduktion von
Fumarat zu Succinat. Die dreidimensionale Kristallstruktur der QFR von Wolinella
succinogenes wurde zuvor mit einer Auflösung von 2,2 Å gelöst.
Obwohl die dihäm-haltige QFR von W. succinogenes erwiesenermaßen einen elektroneutralen
Prozeß katalysiert, hat die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Wild-Typ-
Enzyms und verschiedener Enzymvarianten ergeben, dass die Lage der aktiven Zentren auf
einen über die Membran elektrogenen katalytischen Prozeß hindeutet. Der scheinbare
Widerspruch konnte durch die sogenannte „E-Weg“ Hypothese überwunden werden. Sie
besagt, dass der transmembrane Elektronentransfer über die Hämgruppen strikt an einen
parallelen, die Ladung kompensierenden Protonentransfer gekoppelt ist, Dieser erfolgt über
einen im reduzierten Zustand vorübergehend aktiven Transportweg, der im oxidierten
Zustand des Enzyms blockiert ist. Als wesentliche Bestandteile dieses „E-Weges“ werden die
Seitenkette von Glu C180 und das Ring-C Propionat der distalen Hämgruppe angenommen.
Frühere experimentelle Ergebnisse weisen deutlich auf eine Beteiligung von Glu C180 hin.
13Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mit Hilfe einer Kombination aus C-
Isotopenmarkierung der Hämpropionate der QFR und anschließender FTIR-
Differenzspektroskopie experimentell nachzuweisen, dass dem Ring-C Propionat der
distalen Hämgruppe eine entsprechende Rolle im redox-gekoppelten Protonentransfer in der
QFR von W. succinogenes zukommt.
Zusätzlich zu W. succinogenes sind auch die Primärstrukturen zweier weiterer ε-
Proteobakterien, nämlich Campylobacter jejuni und Helicobacter pylori, bekannt. Beide Spezies
sind im Gegensatz zu W. succinogenes humanpathogen und in der Lage, Schleimhäute zu
kolonisieren und verschiedene Krankheiten auszulösen. Die QFR von H. pylori wurde schon
früher als potentieller Angriffspunkt für eine medikamentöse Behandlung identifiziert.
Gleiches ist auch für die QFR von C. jejuni wahrscheinlich. Die Möglichkeit, die beiden
Chinol:Fumarat Reduktasen der genannten Bakterien zu studieren und somit
möglicherweise effizientere Medikamente gegen sie zu entwickeln, hängt empfindlich davon
ab, über größere Mengen qualitativ hochwertiger Proteinsubstanz zu verfügen. Weiterhin
können die biochemische und strukturelle Untersuchung der QFR Enzyme anderer ε-
iv Zusammenfassung
Proteobakterien als W. succinogenes hilfreich sein, neue Aspekte dieser Klasse von
Membranproteinen zu beleuchten und deren allgemeines Verständnis zu vertiefen.

1. Heterologe Expression in W. succinogenes. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal die
erfolgreiche Überproduktion von Membranproteinen in dem anaeroben Bakterium
W. succinogenes in großem Maßtab vorgestellt. Da sich die homologe Produktion von
QFR aus C. jejuni und H. pylori bis dato nur durch geringe Mengen kaum aktiven und
unreinen Enzyms auszeichnete, wurde eine Methode der heterologen Produktion in
W. succinogenes entwickelt. Zu diesem Zweck wurde das vollständige frdCAB Operon
das die drei Untereinheiten der Chinol:Fumarat Reduktase codiert, in das Genom
ΔfrdCAB W. succinogeneseiner Deletionsmutante von eingefügt. Im Genom dieser
Mutante wurde vorher der komplette Abschnitt, der frdCAB codiert, entfernt, was zu
einem vollständigen Verlust der Fähigkeit der Zellen zur Fumarat-Atmung führte.
Der Austausch der Gene von W. succinogenes durch das heterologe Gen-Cluster ergab
Mutanten, die in vollem Umfang zur Fumarat-Atmung fähig waren. Die QFR der ε-
Proteobakterien ist eine Succinat:Chinon Oxidoreduktase (SQOR) des Typs B, welche
aus drei Untereinheiten besteht: Einer hydrophoben Untereinheit (FrdC), die zwei
Häm b Gruppen enthält, einer großen hydrophilen Untereinheit (FrdA), die ein
Flavinadenindinukleotid (FAD) als prosthetische Gruppe bindet, und einer kleineren
hydrophilen Untereinheit (FrdB), welche die Eisen-Schwefel-Zentren [2Fe-2S], [4Fe-
4S] und [3Fe-4S] umfasst. Es konnte gezeigt werden, dass alle diese Kofaktoren
korrekt in die beiden heterolog produzierten Proteine eingebaut wurden. Dank dieses
neuen heterologen Expressionssystems, konnten die frdCAB Operons der beiden
pathogenen Spezies C. jejuni und H. pylori kloniert und exprimiert werden, so dass
die korrespondierenden Enzyme isoliert und charakterisiert werden konnten.
2. Reinigung der QFR von H. pylori und C. jejuni. Um die QFR der beiden pathogenen
Spezies zu untersuchen, sind große Mengen stabilen, reinen und aktiven Enzyms
erforderlich. Eine solche Verfügbarkeit würde eine Charakterisierung und
Kristallisation der beiden Enzyme im Hinblick auf Röntgenbeugungsexperimente
ermöglichen. Im Vergleich zu früher publizierten Reinigungsprozeduren, wie sie für
die Isolierung der W. succinogenes QFR etabliert wurden, und die im Wesentlichen
aus Anionenaustausch-Chromatographie und isoelektrischer Fokussierung
bestanden, erlaubte es die Hinzufügung einer Gel-Filtration als Reinigungsschritt
v
eine Proteinverunreinigung mit der ungefähren Größe von 55-60 kDa zu eliminieren.
Die relativ einfache Handhabung von W. succinogenes und der hohe Ertrag der
Proteinexpression ermöglichten es, nach dem letzten Reinigungsschritt bis zu 100 mg
C. jejuni QFR und bis zu 150 mg H. pylori QFR je Proteinpräparation zu erhalten.
Dennoch war im Falle der H. pylori QFR nach erfolgter Gelfiltration eine drastische
Abnahme wenn diese durch Verfolgung der Oxidation von DMNH durch Fumarat 2
gemessen wurde Enzymaktivität zu verzeichnen. Daher wurden verschiedene
Methoden zur Bestimmung von an die H. pylori QFR gebundenen Phospholipide
herangezogen, die schließlich die Präsenz von Cardiolipin während der Reinigung
enthüllten. Durch die Zugabe dieses Lipids konnte die enzymatische Aktivität der
QFR vollständig wiederhergestellt werden. Desweiteren verbesserte die Zugabe von
Cardiolipin auch die Kristallisationseigenschaften des Enzyms. Verschiedene
biochemische Analysen, wie z. B. SDS-PAGE und Messungen der enzymatischen
Aktivität, zeigten, dass sich die durchgeführten Proteinpräparationen durch hohe
Reinheit und Homogenität auszeichnen. Der abschließende Beweis für den Erfolg des
entwickelten heterologen Systems zur Proteinüberproduktion war dadurch gegeben,
dass es möglich war, gut beugende dreidimensionale Proteinkristalle zu erhalten. Die
Kristalle der H. pylori QFR beugten bis zu einer Auflösung von 8 Å und C. jejuni QFR
Kristalle bis zu 3,1 Å.
3. Ausführliche Enzymcharakterisierung und Kristallisation der heterolog
produzierten QFRs. Die hohe Qualit&