Biosynthèse des flavan-3-ols chez Vitis vinifera : structure, mécanisme catalytique et première approche cinétique de la leucoanthocyanidine réductase

Chloé Mauge

Description

Sous la direction de Bernard Gallois
Thèse soutenue le 01 juillet 2010: Bordeaux 1
Les flavan-3-ols et leurs polymères, les proanthocyanidines, appartiennent à une famille de flavonoïdes appelée les tannins condensés. Ces composés polyphénoliques jouent un rôle essentiel dans la qualité phytosanitaire des baies de raisin ainsi que dans les propriétés organoleptiques du vin (flaveur, astringence et couleur). La connaissance des mécanismes qui régissent leur biosynthèse est donc primordiale afin de mieux comprendre la mise en place de la typicité d’un vin. Ce mémoire est consacré à l’étude de l’une des enzymes responsables de la synthèse des flavan-3-ols : la leucoanthocyanidine réductase 1 de Vitis vinifera (VvLAR1). Dans une première partie, nous décrivons les conditions d’expression, de purification et de stabilité de l’enzyme recombinante. L’activité enzymatique est démontrée et la configuration 2R,3S des produits réactionnels caractérisée. La seconde partie de ce manuscrit décrit l’étude structurale de l’enzyme. Des monocristaux d’apoenzyme, de complexes binaires (VvLAR1 / NADPH) et d’un complexe ternaire (VvLAR1 / NADPH / (+)-catéchine) ont été obtenus. Les différentes structures permettent de décrire les modifications structurales associées à la fixation du coenzyme puis du produit. Un mécanisme catalytique basé sur les interactions intermoléculaires observées au sein du complexe ternaire est proposé. La troisième partie de ce mémoire est consacrée à la recherche de conditions expérimentales permettant la production et la stabilisation de la leucocyanidine en solution, un des substrats naturels de l’enzyme. Les résultats obtenus permettent une première approche de l’étude des propriétés cinétiques de la VvLAR1.
-Vitis vinifera
-2R3S-flavan-3-ols
-Leucoanthocyanidine réductase
-Structure 3D par diffraction des rayons X
-Mécanisme catalytique
-Stabilité du substrat
-Cinétique enzymatique
Flavan-3-ols and their polymerisation products, proanthocyanidins, belong to a flavonoid family named condensed tannins. These polyphenolic compounds play a major role in the protection of grape berries to intruders and in the organoleptic properties of wine (flavour, astringency and colour). Knowledge of the mechanisms which govern their biosynthesis is thus essential to better understand wine typical composition. The present thesis is devoted to the investigation of one of the two enzymes which catalyse the flavan-3-ols formation: leucoanthocyanidin reductase 1 from Vitis vinifera (VvLAR1). In the first part of the manuscript, we describe the expression, purification and stability conditions of the recombinant enzyme. The enzyme activity is demonstrated and the reaction product 2R,3S configuration is characterised. The second part of this report describes the structural studies of the enzyme. Monocrystals of the apoenzyme and of binaries (VvLAR1 / NADPH) and a ternary (VvLAR1 / NADPH / (+)-catechin) complexes were obtained. These different structures allow the description of the structural changes associated with the coenzyme and then the substrate binding. A catalytic mechanism, based on the intermolecular interactions within the ternary complex, is proposed. The last part of the work is devoted to the investigation of the experimental conditions leading to the stability of leucocyanidin in solution, one of the natural substrates of the enzyme. The results obtained allow a first study of the VvLAR1 kinetic properties.
-Vitis vinifera
-2R3S-flavan-3-ols
-Leucoanthocyanidin reductase
-X-Ray diffraction 3D structure
-Catalytic mechanism
-Substrate stability
-Kinetics of the reaction
Source: http://www.theses.fr/2010BOR14046/document

Sujets

• Cinétique enzymatique

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 95
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 49 Mo

Extrait

N° d’ordre : 4046








THÈSE

PRÉSENTÉE A

L’UNIVERSITÉ de BORDEAUX

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ

Par Chloé MAUGÉ

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR
SPÉCIALITÉ : Biochimie

Biosynthèse des flavan-3-ols chez Vitis vinifera : structure,
mécanisme catalytique et première approche cinétique de la
leucoanthocyanidine réductase

Directeur de recherche : B. GALLOIS



Soutenue le : 1 juillet 2010

Devant la commission d’examen formée de :

M. MOUREY Lionel Directeur de recherche, CNRS Toulouse Rapporteur
M. DANGLES Olivier Professeur, Université d’Avignon Rapporteur
M. SCHMITTER Jean-Marie Professeur, Université Bordeaux 1 Examinateur
M. GALLOIS Bernard Directeur de recherche, CNRS Bordeaux Directeur de thèse

M. CHAUDIÈRE Jean Professeur, Université Bordeaux 1 Invité
M. CHARLIER Laurent Chargé d’études, CIVB Bordeaux Invité

Université Bordeaux 1
Les Sciences et les Technologies au service de l’Homme et de l’environnement

































REMERCIEMENTS

Je tiens tout d’abord à remercier les rapporteurs, L. MOUREY et O. DANGLES, et les
membres du jury, J.M. SCHMITTER J. CHAUDIERE et L. CHARLIER, pour avoir accepté
d’évaluer mes travaux.
Ma thèse ayant été réalisée dans le laboratoire « Chimie et Biologie des Membranes et des
Nanoobjets », je tiens à remercier son directeur, E. DUFOURC, pour m’avoir accueillie.
J’adresse également toute ma gratitude à B. GALLOIS pour avoir dirigé ces recherches et
m’avoir fait confiance pour les réaliser. Je remercie aussi tous les membres de son équipe
pour leur aide et leur soutien, en particulier B. LANGLOIS D’ESTAINTOT pour m’avoir
initiée à la cristallogénèse et pour le travail accompli, T. GRANIER pour m’avoir formée à la
détermination de structure et C. MANIGAND pour ses conseils sur la technique HPLC. Je
remercie aussi J. CHAUDIERE pour son aide et nos discussions prolifiques sur la cinétique et
la chimie organique.
Ce travail pluridisciplinaire m’a permis de mettre en œuvre plusieurs collaborations. Je
remercie donc S. DELROT ainsi que son équipe (ISVV), en particulier C. TROSSAT et C.
LE HENAFF, pour leur aide en biologie moléculaire et pour m’avoir ouvert leurs laboratoires.
Je remercie également J.M. SCHMITTER et son équipe pour les expériences de spectrométrie
de masse. Merci à K. BATHANY pour tout le temps qu’elle m’a accordé.
Au début de mes travaux, j’ai eu la chance de participer à un « Practical Course » à l’EMBL
(PEPC5) lors duquel G. STIER (EMBL) m’a généreusement donné le vecteur pETGB_1a. Je
tiens tout particulièrement à lui exprimer ma gratitude.
Je tiens aussi à remercier le Conseil Interprofessionnel du Vin de Bordeaux pour avoir financé
mes travaux de thèse.
Un grand merci à J. MERIAS et à toute l’équipe secrétariat gestion du laboratoire, en
particulier à P. DULOR et E. DUPOUYET, pour le café du matin qui m’a aidée à bien
commencer les journées. Je remercie aussi tous ceux que j’ai pu croiser et qui ont rendu mon
quotidien plus joyeux : Olivier, Benoît B., Nadia, Nicolas, Benoît F., Caroline, Cassandre et
tous les autres.
Enfin, un remerciement particulier va à ma famille et à mes proches qui ont toujours cru en
moi et m’ont soutenue pendant toute la durée de mes études. Merci à Nirina pour sa patience,
sa compréhension et son soutien de tous les jours.
















































ABREVIATIONS

3D tridimensionnel
3-GT 3-O glucosyltransférase
4CL p-coumarate CoA ligase
ACES acide N-(2-Acétamido)-2-aminoéthanesulfonique
ADA acide N-(2-Acétamido)iminodiacétique
ADN acide désoxyribonucléotide
ADNc acide désoxyribonucléotide complémentaire
ANR anthocyanidine réductase
ANS anthocyanidine synthase
ARN acide ribonucléotide
AVI anthocyanic vacuolar inclusion (inclusion vacuolaire anthocyanique)
Bis-Tris Bis(2-hydroxyéthyl)amino-tris(hydroxyméthyl)méthane
β-ME β-mercaptoéthanol
BSA sérum albumine bovine
C4H cinnamate 4-hydroxylase
CHI chalcone isomérase
CHS chalcone synthase
CIAP phosphatase alcaline de veau
CoA coenzyme A
dATP désoxyriboadénosine triphosphate
dCTP désoxyribocitosine triphosphate
DFR dihydroflavonol 4-réductase
dGTP désoxyriboguanine triphosphate
DHK dihydrokaempférol
DHM dihydromyricetine
DHQ dihydroquercétine
dNTP désoxyribonucléotide triphosphate
DTT dithiothréitol
dTTP désoxyribotymidine triphosphate
dUTP désoxyribouracyl triphosphate
EDTA acide diaminotétracarboxylique
EGS eugénol synthase
EMDF (7S,8S)-éthyl-(7,8-méthylène)-dihydroférulate
ESI electrospray ionisation (ionisation électrospray)
ESI-TOF electrospray ionisation - time of fly (ionisation électrospray - temps de vol)
ESRF european synchrotron radiation facility (Installation européenne de radiation
synchrotron)
EST expressed sequenced tagged (étiquette de séquence exprimée)
ESU estimated standard uncertainty (incertitude standard estimée)
F3'5'H flavonoïde 3',5'-hydroxylase
F3H flavanone 3-hydroxylase
F3'H flavonoïde 3'-hydroxylase
FLS flavonol synthase
FNS flavone synthase
FOM figure of metrit (figure de mérite)
G6P glucose-6-phosphate
G6PDH glucose-6-phosphate déshydrogénase GFP green fluorescent protein
GPC gel permeation chromatography (chromatographie d'exclusion stérique)
GST gluthation S-transférase
HEPES acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique
HPLC hight performance liquid chromatography (chromatographie liquide haute
performance)
IFR isoflavone réductase
IMAC immobilised metal affinity chromatography (chromatographie d'affinité pour un
métal immobilisé)
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
ISVV instut des sciences de la vigne et du vin
LAR leucoanthocyanidine réductase
LAXI milieu de culture LB additionné d'ampicilline, de X-Gal et d'IPTG
LB milieu de culture bactérienne Luria-Bertani
LC/MS couplage HPLC MS
LDL low density lipoprotéin (lipoprotéine de faible densité)
LDOX leucoanthocyanidine synthase
MAD multiple wavelengh anomalous diffraction (diffraction anomale à de multiple
longueurs d'onde)
MATE multidrug and toxic compounds extrusion (extrusion de multiple drogues et
composés toxiques)
MCS multiple cloning site (site de clonage multiple)
MES acide 2-(N-Morpholino)éthanesulfonique
MIR multiple isomorphous replacement (multiple remplacements isomorphes)
MIRAS multiple isomorphous replacement with anomalous scattering (multiple
remplacements isomorphes avec dispersion anomale
MOPS acide 3-(N-Morpholino)propanesulfonique
MS/MS spectromètre de masse fractionnant les molécule couplé à un spectromètre de
masse
+NAD nicotinamide adénine dinucléotide oxydé
NADH nicotinamide adénine dinucléotide réduit
+
NADP nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydé
NADPD nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit deutéré
NADPH nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit
NiNTA matrice agarose - acide iminodiacétique saturée en nickel
NO monoxyde d’azote
PAL phénylalanine ammonia lyase
PCBER phénylcoumaran benzylique éther réductase
PCR polymerase chain reaction (réaction de polymérisation en chaîne)
PDB protein data bank (banque de données des protéines)
PEG polyéthylène glycol
PIP PLR,IFR,PCBER
PIPES acide 1,4-Pipérazinediéthanesulfonique
PLR pinorésinol laricirésinol; réductase
RE réticulum endoplasmique
RP-HPLC HPLC en phase inverse
RT-PCR retrotranscription-PCR (réaction de rétrotranscription en chaîne)
SAD