Cellular separation forces studied by force spectroscopy and microplate manipulation [Elektronische Ressource] / presented by Babak Hadji Hosseini

Babak Hosseini

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• Biologie

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• Publié par: ruprecht-karls-universitat_heidelberg
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 37
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 8 Mo

Extrait

Dissertation
submitted to the
Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of
Doctor of Natural Sciences
presented by
Dipl.-Phys. Babak Hadji Hosseini
born in Tehran, Iran
Oral examination: November 14th, 2008Cellular Separation Forces
Studied by Force Spectroscopy and
Microplate Manipulation
Refeeres: Prof. Dr. Joachim P. Spatz
Prof. Dr. Heinz HornerZusammenfassung
In unserem Immunsystem tasten T-Zellen bestandig antigenprasentierende Zellen (AP-
Zellen) nach antigen-beladenen MHC Molekulen ab, um mit ihren spezi schen T-Zell-
Rezeptoren (TZR) fremdartige Mikroorganismen zu erkennen, welche in den Korp er einge-
drungen sind. In den letzten Jahren wurde deutlich, dass die Adhasion zwischen T-Zellen
und AP-Zellen durch eine spezielle Anordnung der Ober ac henmolekule gekennzeichnet
ist. Die hierbei auftretenden biophysikalischen E ekte sind noch weitgehend unerforscht.
In der vorliegenden Dissertation vergleichen wir die zeitabhangigen Adhasionskrafte
zwischen T-Zell/AP-Zell Paaren bei An- bzw. Abwesenheit von Antigenen an deren
Ober ac he. Die Interaktion der Zellpaare wurde hierbei mit einer Zellziehaparatur vi-
sualisiert und mit den am Rasterkraftmikroskop gemessenen Kraftspektren korreliert.
Wir konnten zeigen, dass die Adhasionskr afte bei Vorhandensein von Antigenen mit
ca. 14 nN bis zu zehnmal hoher sind als im Falle ihrer Abwesenheit. Hierbei liegen die
gemessenen Krafte zwischen den unterschiedlichen Zellpaaren in den ersten 2 Minuten
bei ca. 2nN. Nach einer Adhasionszeit von 15 min steigen die Krafte bei Paaren mit
Antigen an, um nach 30 min ein Maximum zu erreichen. Die Adhasionskrafte bleiben
bei Paaren ohne Antigen im gleichen Zeitraum niedrig. Neben der Gesamtadhasionskraft
zwischen den Zellen wurden desweiteren Einzelmolekulabrisse ausgewertet und mit Hilfe
theoretischer Modelle Einblicke in das Interaktionspotenzial der Proteine gewonnen.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass fremdartige Antigene an der Zellober ache von AP-
Zellen starke Zelladhasion mit T-Zellen auslosen und tragt demzufolge entscheidend zum
besseren Verstandis der Rolle von Kraft in Zell-Zellinteraktion bei.
Abstract
During adaptive immune response, peptides from foreign microorganisms are processed
and displayed on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs) within the cleft of major
histocompatibility complexes (pMHC), which are recognized by T cells that patrol the
body. In recent years, a large spatially organized molecular cluster called immune synapse
(IS) has been identi ed, which forms at the T cell/APC interface. Little is known about the
biophysics of these cell conjugates and it is generally believed that cell adhesion molecules
are activated on the T cell surface after recognition which should subsequently lead to
higher adhesion forces between the two cells. Thus, the goal of this thesis was to measure
the change of total adhesion forces between T cells and APCs when peptide was present
compared to the case when peptide was absent.
In this work, we report the rst measurement of separation forces between T cells and
APCs employing a cell stretcher device and Atomic Force Microscopy (AFM). We analyze
the kinetics of T cells that interact with APCs presenting a foreign peptide by their MHC
(pulsed), and APCs carrying no peptide (unpulsed) for contact times of 0 to 60 minutes.
Unlike pulsed cells, unpulsed APCs did not show the formation of immune synapses.
Forces are comparable for short time points but start to deviate after 15 min to reach a
maximum after 30 min in the pulsed case.
We could correlate single rupture events found in AFM spectra to protein unbinding
theories gaining a deeper insight into the molecular basis for the increase in adhesion
forces. Thus, this work provides an important contribution to the physical understanding
of cell-cell adhesion.ivContents
Abstract iii
I Introduction 1
1 Cellular Adhesion 3
1.1 Cellular structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 Development of adhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 Principles of . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.4 Proteins in adhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.5 Physics of bonds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2 The Immunological Synapse 15
2.1 Adaptive immune system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2 Immune synapse formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3 Signi cance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
3 Techniques Measuring Forces in Living Cells 21
3.1 Micropipette aspiration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2 Optical tweezers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.3 Magnetic tweezers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.4 The Optical Stretcher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.5 Substrate Stretcher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
II Experimental Measurement Techniques 33
4 The Cell Stretcher and its Applications 35
4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.2 Experimental setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.3 Enhanced experimental setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.4 Adhesion contrast . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
5 The Atomic Force Microscope 45
vvi Contents
5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
5.2 Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
5.3 Setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
6 Fluorescent-activated Cell Sorting 53
III Separation Experiments 57
7 Motivation 59
8 Qualitative Observations - Cell Stretcher 63
8.1 Modi ed cell stretcher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
8.2 Experiment preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
8.3 Expts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
8.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
9 AFM Separation Experiments 71
9.1 Characterization of 3B11/LK35.2 conjugates . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
9.2 Experiment preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
9.3 Exptal procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
9.4 Total separation force dynamics for 3B11/LK35.2 pairs . . . . . . . . . . . . 76
9.5 Single rupture events . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
9.6 1934.4/L cells experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
9.7 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
IV Conclusion and Outlook 93
10 95
11 Outlook 97
List of Figures 100
References 114
A Appendix 117
A.1 Abbreviations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
A.2 IL2 Sandwich ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
A.3 Analysis of the Immune Synapse Using ImageStream . . . . . . . . . . . . . 118Part I
Introduction