Characterisation of components and mechanisms involved in redox regulation of protein import into chloroplasts [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Anna Stengel

Anna Stengel

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• Biologie

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 8
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 7 Mo

Extrait

Characterisation of components and mechanisms
involved in redox-regulation of protein import into
chloroplasts










Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
an der Fakultät für Biologie
der Ludwig-Maximilians-Universität München




vorgelegt von

Anna Stengel

München, Mai 2009

























Erstgutachter: Prof. Jürgen Soll
Zweitgutachter: Prof. Jörg Nickelsen

Tag der mündlichen Prüfung: 28. Mai 2009 Table of contents

Sumary 1

Zusamenfasung 3

Introduction 5
The origin of chloroplasts and a general description of protein import 5
The Toc omplex 7
The Tic coplex 8
Alternative import pathways 11
Evolution of the import machineries 12
Regulation pathways of protein import at the outer an inner envelope 14
Redox signals in the chloroplast 15
The thioredoxin system
Redox-mediated regulation of protein import 17
Aim of this study 19

Results 20
Chapter 1: Tic62 - a protein family from metabolism to protein translocation. 22
Chapter 2: Tic62 - redox-regulated translocon composition and dynamics. 35
Chapter 3: Preprotein import into chloroplasts via the Toc and Tic complexes is
regulated by redox signals in Pisum sativum. 48

Discussion 70
Distinctive evolutionary features of Tic62
Redox-dependent properties of Tic62 72
Chloroplast protein import is regulated by various redox signals 75

References 81

List of abbreviations 90
Curriculum Vitae 92
List of publications 93
Danksagung 94
Ehrenwörtliche Versicherung und Erklärung 95Summary

The vast majority of chloroplast proteins is encoded in the nucleus and thus has to be
posttranslationally imported into the organelle, a process that is facilitated by two multimeric
protein machineries, the Toc and Tic complexes (translocon at the outer/inner envelope of
chloroplasts). Regulation of protein import, e.g. by redox signals, is a crucial step to adapt the
protein content to the biochemical requirements of the organelle. In particular, one subunit of
the Tic complex, Tic62, has been proposed as a redox sensor, whose possible function is to
regulate protein import by sensing and reacting to the redox state of the organelle. To
elucidate a potential redox regulation of protein import, structural features, redox-dependent
properties and the evolutional origin of Tic62 were investigated. The results show that Tic62
consists of two very different modules: the N-terminal part was found to be mainly α-helical
and possesses dehydrogenase activity in vitro. It is furthermore an evolutionary ancient
domain, as it is highly conserved in all photosynthetic organisms from flowering plants to
cyanobacteria and even green sulfur bacteria. In contrast to this, the C-terminus is largely
+disordered and interacts specifically with ferredoxin-NADP oxidoreductase (FNR), a key
enzyme in photosynthetic electron transfer reactions. Moreover, this domain was found to
exist only in flowering plants, and thus the full-length Tic62 protein seems to be one of the
evolutionary youngest Tic components. The results of this study make also clear that Tic62 is
a target of redox regulation itself, as its localization and interaction properties depend on the
metabolic redox state: oxidized conditions lead to fast membrane binding and interaction with
the Tic complex, whereas reduced conditions cause solubilization of Tic62 into the stroma
and increased interaction with FNR. This novel shuttling behaviour indicates a dynamic
+composition of the Tic complex. The NADP /NADPH ratio was furthermore found to be able
to influence the import efficiency of many precursor proteins. Interestingly, the import of not
all preproteins depends on the stromal redox state. Hence it was proposed that not a single
stable Tic translocon exists, but several Tic subcomplexes with different subunit
compositions, which might mediate the import of different precursor groups in a redox-
dependent or -independent fashion. Another redox signal that was analyzed in regard to an
impact on protein import is the reversible reduction of disulfide bridges, which was found to
affect the channel and receptor proteins of the Toc complex. The import of all proteins that
use the Toc translocon for entering the chloroplast was shown to be influenced by disulfide
bridge formation. Thus it can be concluded that a variety of redox signals, acting both on the
Toc and Tic complexes, are able to influence chloroplast protein import.
1Zusammenfassung

Die Mehrzahl der in den Chloroplasten lokalisierten Proteine ist im Nukleus kodiert und muss
folglich posttranslational in das Organell importiert werden. Dieser Prozess wird von zwei
multimeren Proteinkomplexen bewerkstelligt, den so genannten Toc und Tic Komplexen
(translocon at the outer/inner envelope of chloroplasts). Die Regulation des Proteinimports,
z.B. durch Redoxsignale, ist äußerst wichtig um den Proteingehalt an die biochemischen
Anforderungen des Chloroplasten anzupassen. Eine der Untereinheiten des Tic Komplexes,
Tic62, wurde als potentielles Sensorprotein vorgeschlagen, welches den Proteinimport
regulieren könnte, indem es den Redoxzustand in den Chloroplasten misst und diese
Information an den Tic Komplex weitergibt. Um Einblicke in die Redoxregulation des
Proteinimports zu erhalten, wurden in dieser Arbeit die Struktur, die redox-abhängigen
Eigenschaften und der evolutionäre Ursprung von Tic62 untersucht. Die Ergebnisse legen
nahe, dass Tic62 aus zwei sehr verschiedenen Modulen besteht: der N-terminale Teil besitzt
in vitro Dehydrogenaseaktivität und besteht vor allem aus α-Helixes. Außerdem handelt es
sich bei diesem Teil um eine evolutionär sehr alte Domäne, da sie in allen photosynthetischen
Organismen von Blütenpflanzen bis zu Cyanobakterien und sogar grünen Schwefelbakterien
stark konserviert ist. Im Gegensatz dazu weist der C-Terminus eine ungeordnete Struktur auf
+und vermittelt die spezifische Interaktion mit der Ferredoxin-NADP -Oxidoreduktase (FNR),
welches ein Schlüsselenzym in photosynthetischen Elektronentransportprozessen darstellt.
Außerdem wurde diese Domäne ausschließlich in Blütenpflanzen gefunden, deshalb scheint
das vollständige Tic62 Protein eine der evolutionär jüngsten Tic Komponenten zu sein.
Außerdem konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Tic62 selber durch
Redoxsignale reguliert wird, da seine Lokalisierung und Interaktionseigenschaften vom
metabolischen Redoxzustand abhängig sind: oxidierte Bedingungen führen zu einer schnellen
Bindung von Tic62 an Membranen und zu einer verstärkten Interaktion mit dem Tic
Komplex, wohingegen reduzierte Bedingungen eine bevorzugte stromale Lokalisierung von
Tic62 auslösen, was mit einer stärkeren Interaktion mit der FNR einhergeht. Dieses neuartige
Verhalten einer Tic Komponente impliziert eine dynamische Zusammensetzung des Tic
Komplexes. Es konnte zusätzlich gezeigt werden, dass der stromale Redoxzustand in der Lage
ist, die Importeffizienz von vielen Vorstufenproteinen zu beeinflussen. Interessanterweise ist
nicht der Import von allen Vorstufenproteinen vom metabolischen Redoxzustand abhängig.
Daher ist es möglich, dass nicht ein einziger Tic Komplex, sondern verschiedene
Subkomplexe mit unterschiedlichen Zusammensetzungen existieren, welche den Import von
2verschiedenen Klassen von Vorstufenproteinen redox-abhängig oder -unabhängig regulieren
können. Die reversible Reduktion von Disulfidbrücken in den Kanal- und Rezeptorproteinen
des Toc Komplexes wurde als weiteres Redoxsignal untersucht, das ebenfalls den
Proteinimport regulieren kann. Es konnte gezeigt werden, dass der Import aller
Vorstufenproteine, welche den Toc Komplex zum Eintritt in den Chloroplasten benötigen,
von der Disulfidbrückenbildung beeinflusst wird. Somit kann die Schlussfolgerung gezogen
werden, dass eine Reihe von unterschiedlichen Redoxsignalen, die sowohl am Toc als auch
am Tic Komplex wirken, in der Lage sind, den Proteinimport zu beeinflussen.
3Introduction

The origin of chloroplasts and a general description of protein import
Plastids are a diverse group of organelles found in all plants and algae. Members of this
family include amyloplasts, which store large amounts of starch, chromoplasts, which
accumulate red, orange or yellow carotinoid pigments and elaioplasts, which stor