Characterization of clathrin heavy chain 22 in epithelial and skeletal muscle cells [Elektronische Ressource] / von Peter-Christopher Esk

Christopher Esk

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 62
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 8 Mo

Extrait

Characterization of clathrin heavy chain 22 in
epithelial and skeletal muscle cells













Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
genehmigte Dissertation
von

Dipl.-Biochem. Peter-Christopher Esk
geboren am 28. Januar 1978 in Hannover

September 2008





















Referent: Prof. Dr. Ernst J. Ungewickell
Korreferentin: Prof. Frances M. Brodsky, DPhil


Tag der Promotion: 26. September 2008

Eidesstattliche Erklärung
Eidesstattliche Erklärung


Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und
nur unter der Verwendung der angegebenen Quellen und Hilfsmittel verfasst habe.

Weiterhin erkläre ich an Eides statt, dass diese Dissertation nicht schon als Diplom- oder
ähnliche Prüfungsarbeit verwendet wurde.

San Francisco, den 10.06.2008



(Peter-Christopher Esk)











3 Zusammenfassung
Zusammenfassung

Die universelle Clathrin schwere Kette (CHC17) ist seit langem als Hüllprotein in
Transportvorgängen, insbesondere der Clathrin-vermittelten Endozytose bekannt.
Weiterhin konnte eine Rolle für CHC17 im Aufbau der mitotischen Spindel nachgewiesen
werden. Clathrin schwere Kette 22 (CHC22) ist eine Isoform von CHC17, welche in allen
Geweben schwach, in Skelettmuskel hingegen stark exprimiert wird. Obwohl zu 85 %
identisch mit CHC17, wurde bislang keine Funktion für CHC22 gefunden.

In dieser Arbeit wird die Funktion von CHC22 als unabhängig von CHC17 definiert, auch
kann CHC22 CHC17 nicht bei dessen Verlust ersetzen. CHC22 wird dagegen eine Rolle
in einem CHC17-unabhängigen endosomalen Sortierungsvorgang zugewiesen. Dieser
wird von ausgewählten Frachtmolekülen, unter anderem den Mannose-6-Phosphat
Rezeptoren und Shiga-Toxin beim Transport von Endosomen zum Trans-Golgi Netzwerk
genutzt. Der CHC22-abhängige Schritt folgt CHC17- und retromer-abhängigen nach.

In humanen Muskelzellen konnte eine Funktion von CHC22 für die Bildung GLUT4-
speichernder Sekretvesikel gezeigt werden. CHC17 spielt hingegen keine Rolle in deren
Aufbau. GLUT4-speichernde Sekretvesikel sind abhängig von Membrantransport aus
dem Endosom und dem Trans-Golgi Netzwerk stammend. Verlust von CHC22 führt zum
Verlust GLUT4-speichernder Vesikel. Gleichzeitig verlieren die Zellen ihre Insulin-
reaktivität hinsichtlich Zuckeraufnahme, was die Wichtigkeit von CHC22 unterstreicht.

Schlagwörter: Clathrin, Membrantransport, Endosom

4 Abstract
Abstract

The ubiquitous clathrin heavy chain, CHC17, is well characterized as a coat protein in
membrane traffic, particularly its role in receptor-mediated endocytosis has been studied
in great detail. In addition, a role for CHC17 in formation of the mitotic spindle has been
described. Clathrin heavy chain 22 (CHC22) is an isoform of CHC17 present in all
tissues with increased expression in skeletal muscle. Despite exhibiting 85 % sequence
identity to CHC17, CHC22 function remained elusive so far.

In this study CHC22 function is revealed to be independent of CHC17. Also, CHC22 may
not compensate for loss of CHC17 in either CHC17-mediated membrane trafficking or
formation of the mitotic spindle. Instead, CHC22 functions in a discrete endosomal
sorting step required by select cargo molecules including mannose-6-phosphate
receptors and Shiga-toxin for retrograde trafficking from endosomes to the trans-Golgi
network. This sorting step occurs downstream of CHC17- and retromer-mediated
retrograde sorting at the early endosome.

In skeletal muscle CHC22 is found to be required for function of the insulin-responsive
GLUT4 storage compartment. In contrast, function of this compartment is CHC17-
independent. The GLUT4 storage compartment depends on delivery of the glucose
transporter 4 from endosomes and the trans-Golgi network. Depletion of CHC22 leads to
complete loss of this compartment alongside loss of insulin responsiveness regarding
glucose uptake in skeletal muscle, highlighting CHC22 s importance in this pathway.

Key words: clathrin, membrane traffic, endosome

5
Table of Contents
Table of Contents
Eidesstattliche Erklärung...................................................................................3
Zusammenfassung .............................................................................................4
Abstract ...............................................................................................................5
Table of Contents ...............................................................................................6
Abbreviations......................................................................................................9
List of figures ....................................................................................................12
Chapter 1 - Introduction ...................................................................................14
Intracellular membrane transport...................................................................14
Coat proteins ...................................................................................................14
The clathrin coat.....................................................................................15
Adaptor proteins for clathrin mediated vesicular trafficking.....................17
Cargo in membrane traffic ..............................................................................19
Clathrin heavy chains......................................................................................21
Skeletal muscle differentiation.......................................................................22
The GLUT4 storage compartment ..................................................................23
Aim ...................................................................................................................25
Chapter 2 - Distinct functions for clathrin heavy chain isoforms in
endosomal sorting............................................................................................27
Abstract............................................................................................................29
Introduction......................................................................................................30
Results .............................................................................................................33

6 Table of Contents
CHC22 associates with peripheral membranes but does not partake in
CHC17 function......................................................................................33
CHC17 and CHC22 act independently in endosomal sorting..................39
Both CHC17 and CHC22 contribute to Golgi morphogenesis .................48
CHC22 plays a similar role in endosomal sorting in human skeletal
muscle ...................................................................................................50
Discussion .......................................................................................................54
Material and Methods......................................................................................61
Antibodies, recombinant proteins and siRNAs........................................61
Cell culture, transfection, Brefeldin A treatment and STxB-internalization
...............................................................................................................62
Hexosaminidase secretion .....................................................................63
Cell fractionation and immunoblotting.....................................................64
Immunofluorescence..............................................................................64
Additional information.....................................................................................66
Chapter 3 - A role for the CHC22 clathrin heavy chain isoform in glucose
metabolism by human skeletal muscle ..........................................................67
Abstract............................................................................................................69
Main text...........................................................................................................70
CHC22 clathrin associates with the GLUT4 transport pathway...............71
CHC22 expression is required for formation of the GLUT4 storage
compartment in human myotubes ..........................................................75
CHC22-transgenic mice show diabetic symptoms..................................80
Aberrant sequestration of GLUT4 membrane traffic components in
CHC22-transgenic mice .........................................................................86
Model for