Comprehensive bioinformatic analysis of kinesin classification and prediction of structural changes from a closed to an open conformation of the motor domain [Elektronische Ressource] / presented by Xiao Liu

Xiao Liu

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• Biologie

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 18
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 8 Mo

Extrait

Comprehensive bioinformatic analysis of kinesin
classification and prediction of structural changes from a
closed to an open conformation of the motor domain


Dissertation

Presented by

Xiao Liu

Institute of Cell Biology
Ludwig-Maximilians-University Munich

Submitted on 26.08.2009





Co-Supervisors: Prof. Dr. Manfred Schliwa and Prof. Dr. John Parsch






































Promotionsgesuch eingereicht am 26.08.2009
Die Arbeit wurde angeleitet und betreut von Prof. Manfred Schliwa
Pruefungsausschuss: Vorsitz: Prof. Manfred Schliwa
1. Gutachter: Prof. John Parsch
2. Gutachter: Prof. Michael Schleicher
3. Protokoll: Prof. Dirk Metzler
Tag der muendlichen Pruefung: 26.11.2009
Zusammenfassung

Die Kinesine sind eine von den drei grossen Motorproteinfamilien in eukaryotischen
Zellen und spielen eine bedeutende Rolle fuer vielfaeltige intrazellulaere
Transportvorgaenge von den Zellbaustoffen. Die Kinesine sind ATPasen, welche die
durch Spaltung von ATP freigesetzte chemische Energie in mechanische Energie
umwandeln und sich entlang der Mikrotubuli bewegen. Nicht nur eine grosse Menge
von Organellen, Proteinkomplexen und mRNA werden von den Kinesinen
transportiert, sondern auch die Bildung des Spindelaparates ist von den Kinesinen
abhaengig.
Die bisherige phylogenetische Analyse fuehrte zu dem Ergebnis, dass die
Kinesin-Superfamilie vierzehn Unterfamilien enthaelt. Ob diese Anzahl an
Unterfamilien der Realitaet entspricht oder weitere Klassen existieren ist noch
fraglich, da bisherige Analysen auf einem relative kleinen Datensatz von
Kinesin-Sequenzen (<600) basieren. In diesem Projekt wurden umfangreiche
bioinformatische Analysen fuer eine grossen Kinesindatensatz (2530 Sequenzen)
ausgefuehrt.
Sechzehn konservierte Motive wurden durch die Sequenzenanalysen in der
Motordomaene identifiziert. Waehrend das ATP-Bindemotif und das
Mikrotubuli-Bindemotif eine wichtige Rolle fuer die Enzymfunktion der Kinesine
spielen, sind die anderen Motive fuer die Stabilisierung und Konformationsaenderung
der Motordomaene von grosser Bedeutung.
Eine hochqualitativer phylogenetischer Baum mit 2530 Sequenzen wurde mit einer
Maximum-likelihood Methode konstruiert. Die Qualitaet des Baumes wurde mit einer
neuen Methode zur Bestimmung der Datenverlaesslichkeit berechnet. Die
phylogenetische Analyse hat alle vierzehn Kinesinunterfamilien bestaetigt. Dreizehn
davon werden von dem phylogenetischen Baum gut unterstuetzt (>90%). Der
Konfidenzwert von dem Kinesin-12 Teilbaum ist zwar nur 73%, aber die
Taxaverteilung zeigt eindeutig, dass dieser Teilbaum eine Unterfamilie bildet.

Zusaetzlich wird ein automatisches profibasiertes Klassifikationsprogramm
implementiert und ist online benutzbar. Die Genauigkeit der Programme liegt bei 85%.
Das erleichtert die Erkennung und Klassifikation von neuen Kinesinsequenzen.
Kinesin-1, auch konventionelles Kinesin genannt, ist das am besten studierte Kinesin.
Interesanterweise bewegt sich das fungale Kinesin-1 4-5 mal schneller als das
tierische Kinesin-1. Geschwindigkeitsbestimmende Faktoren sind ein interessantes
Thema. Fruehere Experimente mit Proteinchimaeren haben gezeigt, dass die
Motordomaene die Geschwindigkeit kontrolliert. Weitere Mutageneseuntersuchungen
von der Motordomaene waeren nicht sinnvoll, da es immer noch unbekannt ist, ob es
sich bei dem Faktor um eine bestimmte Aminosaeure oder eine komplexe
Kombination von mehreren Aminosaeueren handelt.
Mit den komparativen Sequenzanalysen von Pilzkinesin-1 und tierischem Kinesin-1
wurden viele gruppenspezifische Aminosaeuren identifiziert. Viele davon befinden
sich in den funktionellen Motiven, wie z.B. das ATP-bindende Motiv und das
Mikrotubuli-bindende Motiv. Solche Aminosaeuren sind anscheinend fuer die
Funktionsunterschiede verantwortlich. Die anderen sind in weiteren wesentlichen
struktuellen Elementen verstreut.
Der Vergleich der gruppenspezifischen Aminosaeuren in den dreidimensionalen
Strukturen (1BG2 und 1GOJ) fuehrte zu der Entdeckung wichtiger
Konformationsaenderungen zwischen einer geoeffneten und einer geschlossenen
Komformation von der Motordomaene. Die meisten der gruppenspezifischen
Aminosaeuren sind an den raeumlichen Interaktionen mit anderen
gruppenspezifischen oder konservaierten Aminosaeuren beteiligt. Viele solche
Interaktionen sind nur in der geschlossenen Konformation zu beobachten. Die
funktionellen Motive, wie z.B. Switch-I, Loop-11, β5 usw. sind dadurch mit dem
β-Kern der Motordomaene verbunden. In der geoeffneten Konformation sind solche
Bindungen geloest und somit werden die funktionellen Motiven frei fuer die Bindung
an Mikrotubuli. Andererseits kommen neue Bindungen zustande, welche verhindern,
dass die Struktur der Motordomaene in der geoeffneten Konformation
auseinanderfaellt.

Die die Konformationsaenderung kontrollierenden Bindungen haben wertvolle
Hinweise fuer das Zusammenspiel von Funktion und Struktur geliefert und neue
Einblicke in die Geschwindigkeitskontrolle von Kinesin-1 gegeben. Insbesondere sind
die Bindungen in der ATP-Bindungstasche von grosser Bedeutung, weil hier die
Energie, welche die Motilitaet der Motordomaene antreibt, generiert wird. Die
Strukture der ATP-Bindungstaschen von Pilz und Tier sind sehr aehnlich bis auf
einige gruppenspezifische Aminosaeuren. Diese sind zwar wichtig fuer die
Regulierung der ATP-Hydrolyse, aber nicht ausreichend fuer die
Geschwindigkeitskontrolle. Einige weitere Bindungen zwischen der ersten und der
zweiten Lage von Aminosaeuren in der ATP-Bindungstasche wurden entdeckt. Alle
solche Bindungen koennen als Hinweise fuer die Planung zukuenftiger Experimente
dienen und letztendlich helfen, den Mechanismus der Kinesinmotilitaet zu verstehen.
Mit dem rasanten Wachstum des Proteindatensatzes in den oeffentlichen Datenbanken
kommen immer mehr neue Kinesine ins Spiel. Um einen aktuellen Ueberblick ueber
die Gesamtheit der Kinesinsequenzen zu ermoeglichen, wurde ein Kinesin Webserver
aufgebaut. Neue Kinesine werden automatisch gesammelt und klassifiziert. Die
Benutzer koennen die in den Webserver integrierten Programme benutzen, wie z.B.
classification, conservation calculation, motif search, discriminating residues search,
3D structure analyses, um die inder Datenbank vordefinierten Kinesinunterfamilien
oder eigene Sequenzvergleiche zu analysieren.
Die in dieses Projekt verwendeten Methoden sind nicht nur fuer Kinesinanalysen
geeignet, sondern auch fuer alle anderen Proteinfamilien. Dazu sind einige weitee
Programme auch in den Webserver integriert. Der Webserver findet sind unter
www.bio.uni-muenchen.de/~liu/kinesin_new.
I
Summary
Kinesins form a large microtubule-associated motor protein super-family that can be
found in every eukaryotic genome sequenced so far. Not only is the translocation of a
large number of organelles, protein complexes and mRNAs carried out by them, but
also the formation of the meiotic spindle and mitotic spindle integrity are strongly
dependent on the kinesins.
Fourteen different sub-families of kinesin have been reported. However, previous
analyses were based on a relatively small number of selected kinesins (<600
sequences). Whether new classes of kinesin exist or the old classification system will
hold as new sequence data become available is unknown.
In this project, comprehensive computational analyses were performed on a large
kinesin dataset (2,530 sequences). Sixteen conserved motifs were identified within the
motor domain, including the ATP-binding motifs, microtubule-binding interface and
many conserved secondary structural elements. Phylogenetic analysis confirmed the
fourteen sub-family classification scheme. Thirteen of sub-families were well defined
and statistically supported. The kinesin-12 sub-family had less support, with a clade
confidence of 73%.
In addition, a profile-based, automatic classification program was implemented
according to the fourteen kinesin sub-groups. The accuracy of the program is over 85%,
which makes the detection and classification of new kinesin sequences fast and easy.
Kinesin-1, formerly known as conventional kinesin, is the best-studied member of the
kinesin super-family. Motility studies have revealed an interesting phenomenon that
the fungal kinesin-1s move 4-5 times faster than the animal kinesin-1s in general.
Determining the sequence and structural factors that are responsible for the velocity
difference is a topic of current research. Previous protein-chimera experiments have
determined that the motor domain is essential for speed control. However, detailed
analyses of the motor domain through mutagenesis have presented many challenges to
biologists, because it is still unknown whether the speed is controlled by one particular
amino acid residue or by a complex combination of several residues.
With comparative analyses of the primary