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Development of tissue engineering strategies for supporting regeneration after injuries of the nervous system [Elektronische Ressource] / Kristina Belladonna Klinkhammer

De
229 pages
Development of tissue engineering strategies for supporting regeneration after injuries of the nervous system Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation vorgelegt von Diplom-Chemikerin Kristina Belladonna Klinkhammer (geb. Feil) aus Herdecke Berichter: Universitätsprofessor Dr. Martin Möller Universitätsprofessor Dr. Doris Klee Tag der mündlichen Prüfung: 05.12.2011 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar. ii Acknowledgment Diese Arbeit entstand in der Zeit von Juni 2005 bis Mai 2009 am DWI e. V. an der RWTH Aachen und wäre ohne die großartige Hilfe vieler Menschen nicht möglich gewesen. Zunächst danke ich Herrn Prof. Martin Möller für die Möglichkeit, dieses interessante Thema bearbeiten zu dürfen. Frau Prof. Doris Klee danke ich für die Betreuung meiner Arbeit und die Anregungen und Diskussionen hierzu. Ich danke ihr für ihre Unterstützung und ihren Rückhalt. Ich danke außerdem PD Dr. Gary Brook und Prof. Dr. Jörg Mey für die Assistenz bei der Betreuung meiner Arbeit.
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Development of tissue engineering strategies for supporting
regeneration after injuries of the nervous system







Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen
University zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften
genehmigte Dissertation


vorgelegt von

Diplom-Chemikerin
Kristina Belladonna Klinkhammer (geb. Feil)


aus Herdecke


Berichter: Universitätsprofessor Dr. Martin Möller
Universitätsprofessor Dr. Doris Klee


Tag der mündlichen Prüfung: 05.12.2011



Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.










































ii
Acknowledgment

Diese Arbeit entstand in der Zeit von Juni 2005 bis Mai 2009 am DWI e. V. an der RWTH
Aachen und wäre ohne die großartige Hilfe vieler Menschen nicht möglich gewesen.

Zunächst danke ich Herrn Prof. Martin Möller für die Möglichkeit, dieses interessante Thema
bearbeiten zu dürfen. Frau Prof. Doris Klee danke ich für die Betreuung meiner Arbeit und
die Anregungen und Diskussionen hierzu. Ich danke ihr für ihre Unterstützung und ihren
Rückhalt. Ich danke außerdem PD Dr. Gary Brook und Prof. Dr. Jörg Mey für die Assistenz
bei der Betreuung meiner Arbeit. Durch sie habe ich wertvolle Einblicke in biologische und
medizinische Fragestellungen bekommen und gelernt, über den „chemischen“ Tellerrand zu
schauen. Ein besonderer Dank gilt PD Dr. Paul Dalton für die Einführung in das Thema und
seine Ratschläge bei den verschiedensten Fragen.

Ich danke allen Kollegen im AK Klee für die freundliche Atmosphäre und die
wissenschaftliche Gespräche, die meine Arbeit immer wieder bereichert haben. Insbesondere
bedanke ich mich bei Dirk Grafahrend für seine Hilfe bei allerlei chemischen Fragestellungen.

Ich bedanke mich bei allen Mitarbeitern am Universitätsklinikum Aachen und am Lehrstuhl
für Biologie II der RWTH Aachen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Dies
gilt insbesondere für Eva Schnell, Nadine Seiler, José Gerardo-Nava und Julia Bockelmann,
die durch die gute Zusammenarbeit und die Durchführung der zellbiologischen Versuche
diese Arbeit überhaupt erst möglich gemacht haben.

Ein großes Dankeschön geht an meine Forscher Sebastian Kühl und Holger Leonards für die
Bearbeitung wichtiger Themen im Rahmen dieser Arbeit. Hara Simitzis danke ich besonders
für ihren großartigen Fleiß, ihr Durchhaltevermögen und insbesondere für ihre Freundschaft.

Ich bedanke mich bei allen HiWi-Studenten, die wertvolle Arbeit zum Gelingen dieser Arbeit
geleistet haben und nicht müde geworden sind, unzählige Substrate vorzubereiten und Daten
auszuwerten.

Den Mitarbeitern des DWI und der MC danke ich für die angenehme Arbeitsatmosphäre und
die stetige Bereitschaft, bei Problemen auszuhelfen. Mein ganz besonderer Dank gilt Stefan
iii
Rütten für die tausenden von REM-Aufnahmen, die er für mich gemacht hat. Außerdem
danke ich Dr. Robert Kaufmann für die XPS-Messungen und Dr. Ahmed Mourran für die
Aufnahmen mit dem konfokalen Raman-Mikroskop und die wertvollen Diskussionen über die
Interpretation der Ergebnisse. Meinen Büronachbarn Dr. Petra Mela und Dr. Rostislav
Vinokur danke ich für die gute Stimmung im Büro. Vielen lieben Dank an meine
Auszubildende Jana Wiese für ihre große Hilfe bei der Probenvorbereitung und den Spaß, den
wir zusammen hatten.
Heidrun, Melanie, Mona, Haika, Priya, vielen lieben Dank für eure Freundschaft!

Ich danke allen, die diese Arbeit Korrektur gelesen haben und sie durch ihre Anregungen
entscheidend verbessert haben. Hierbei ist besonders Dr. David Martin zu nennen, der mir
stets schnell und zuverlässig geholfen hat.

Ganz besonders bedanke ich mich bei meiner Familie; ich danke meinen Eltern, meiner
Schwester und meinen Schwiegereltern für die langjährige Unterstützung und das Interesse an
meiner Arbeit. Meinem Mann danke ich für seine Liebe, für seine Geduld und dafür, dass er
mich immer unterstützt.













iv
Table of Content

List of Abbreviations vi
Summary x
Zusammenfassung xiii

Chapter 1 Introduction 1
Chapter 2 State of the art 7

I Blends of poly( -caprolactone) and collagen
Chapter 3 Electrospinning and investigation of fibres of poly( -caprolactone) 42
(PCL)/collagen blends
Chapter 4 682-dimensional substrates of poly( -caprolactone) and
PCL/collagen blends for in vitro investigations
Chapter 5 90In vitro investigations on electrospun fibres of poly( -
caprolactone) and poly( -caprolactone) /collagen

II Poly( -caprolactone)-block-poly(ethylene oxide) block copolymers
Chapter 6 119Synthesis and electrospinning of poly( -caprolactone)-b-
poly(ethylene oxide) block copolymers
Chapter 7 Synthesis and electrospinning of a GRGDS-functionalised poly( - 156
caprolactone)-b-poly(ethylene oxide) block copolymer

III Blends from star shaped NCO-poly(ethylene glycol)-stat-poly(propylene glycol)
and poly( -caprolactone)
Chapter 8 175Functionalisation of electrospun fibres of poly( -caprolactone) and
star shaped NCO-poly(ethylene glycol)-stat-poly(propylene
glycol) for neuronal cell guidance

CV 210
List of publications 211



v
List of Abbreviation

°C degree Celsius
3D three dimensional
Ǻ angstrom
ABD antibody diluent
Ala alanine
Arg arginine
Asp aspartatic acid
b block
BHT 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol
Boc-PEO-OH di-tert-butylcarbonate mono-protected poly(ethylene oxide)
CDCl deuterated chloroform 3
cFN cellular fibronectin
cm centimetre
CNS central nervous system
CO carbon dioxide 2
CPCL25 a blend of PCL with 25 wt% type I collagen from calf skin
d days
DAPI 4’,6-diamidino-2 phenyilindole dihydrochloride
DCM dichloromethane
DFG German research society (Deutsche Forschungsgemeinschaft)
DIV days in vitro
DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium
DMF dimethylforamide
DMSO ethyl sulfoxide
DRG dorsal root ganglia
DSC differential scanning calorimetry
DWI Deutsches Wollforschungsinstitut
ECM extracellular matrix
EDC 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide
eq equivalent
EtZn diethyl zinc 2
eV electron volt
vi Abbreviation
FCS fetal calf serum
fig figure
g gram
ga gauge
Gly glycine
GPC gel permeation chromatography
GRGDS one letter code of the peptide sequence glycine-arginine-glycine-
aspartic acid-serine
HN-PEO -amino-hydroxy poly(ethylene oxide) 2
HCl*EtO HCl*diethyl ether 2
Ile isoleucine
k kilo
kDa kilodalton
kV kilovolt
Lys lysine
M molar
mA milliampere
MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid
min minute
mL millilitre
mm illimetre
Mn molecular weight (number average)
MPEO 10k MPEO with a molecular weight of 10000 g/mol
MPEO 5k olecular weight of 5000 g/mol
MPEO mono methyl ether poly(ethylene oxide) (=MeO-PEO-OH)
MW molecular weight (weight average)
NaCl sodium chloride
NaOH hydroxide
NCO isocyanate
NF200 antibody against neurofilament 200 kDa
NFG nerve growth factor
NGS normal goat serum
NHS N-hydroxysuccinimide
NMP N-methylpyrrolidone
vii
NMR nuclear magnetic resonance
p.a. per analysis
PBS phosphate buffered saline buffer
PCL poly( -caprolactone)
PCL-ol PCL-diol
PDI polydispersity index (=MW/Mn)
PEG poly(ethylene glycol)
PEO oxide)
PEO-b-PCL poly(ethylene oxide)-b-poly( -caprolactone)
pFN plasma fibronectin
PLLA poly(L-lactic acid)
PNS peripheral nervous system
P-PEG abbreviation for PCL/sPEG blends
PMMA poly(methyl methacrylate)
PPol-PEG abbreviation for PCL/PCL-diol/sPEG blends
pTSA para-toluene sulfonic acid
RGD one letter code of the peptide sequence arginine-glycine-aspartic acid
RT room temperature
RWTH Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule
S100 antibody to mark Schwann cells
SC Schwann cell
sec second
SEM scanning electron microscope
Sn(Oct) stannous II octoate 2
sPEG star-shaped poly(ethylene oxide)-stat-poly(propylene oxide)
TBS-T tris-buffered saline with Triton X
T crystallisation temperature c
TE tissue engineering
THF tetrahydrofuran
T melting temperature m
TMS tetramethyl silane
Tyr tyrosine
UV ultraviolet
Val valine
viiiAbbreviation
v/v volume per volume
vs versus
w/v weight per volume
wt% percent
XPS X-ray photoelectron spectroscopy
YIGSR one letter code of the peptide sequence tyrosine-isoleucine-glycine-
serine-arginine
g microgram
l icrolitre

ix
Summary

This thesis deals with the preparation of artificial guiding structures for supporting
regeneration after nerve injuries. Injuries of the nervous system can have serious
consequences such as the loss of motoric and sensoric function. As existing treatment
methods for the peripheral nervous system (PNS) include several unsatisfying deficits and due
to the absence of efficient treatment for injuries of the central nervous system (CNS), the
development of an artificial scaffold for supporting nerve regeneration in both the PNS and
CNS is highly desirable. Chemical composition, mechanical properties and oriented structures
for aligned guidance of recovering nerves are important issues for such scaffolds.
The method of electrospinning was applied to produce highly oriented fibres from
different materials with low densities to achieve oriented cell growth and aligned extensions
from a variety of neuronal and non-neuronal cells. For in vitro experiments fibres were
collected onto glass cover slips which were surface functionalised with a thin hydrogel layer
based on star-shaped poly(ethylene glycol)-stat-poly(propylene glycol) (sPEG). The sPEG
layer demonstrated non-adhesive properties towards cells and proteins which enabled
controlled investigation of the effects actuated by the fibres. Additionally the sPEG layer
allowed durable adhesion of the electrospun fibres on the substrates during several analytics
and in vitro experiments.
Three different polymeric materials were developed and electrospun into fibres.
Blends of poly( -caprolactone) (PCL) and the extracellular matrix protein (ECM) collagen
were prepared by mixing and dissolving different ratios of the two polymers in a sufficient
solvent. Electrospinning of the mixtures demonstrated a high dependency of the fibre quality
on solution concentration and PCL-collagen ratio. High quality electrospun fibres were
homogeneous, defect-free and had a small fibre diameter distribution. For oriented fibres, the
degree of orientation and the absence of junctions between single fibres were important
criteria. While high quality random fibres could be obtained at a certain electrospinning
solution concentration from all PCL-collagen mixtures, reproducible high qualities of oriented
suspended fibres were only obtained at a PCL-collagen ratio of 3:1. Fibre diameters were
between 0.4 – 2.4 m. Several analytical methods including antibody staining against
collagen, x-ray photoelectron spectroscopy, infra red spectroscopy, and confocal raman
spectroscopy demonstrated the existence of collagen at the fibre surface. In a first approach of
in vitro experiments, oriented electrospun fibres of PCL/collagen blend containing 25 wt% of
collagen were applied directly onto sPEG coated cover slips. Pure PCL fibres served as
x