Développement d'une approche originale de mesure directe de la respiration de Pseudomonas nautica à l'échelle cellulaire par cytométrie en flux, Development of a new method to measure bacterial respiration at the single cell level by flow cytometry

Lounis Mebarek

Description

Sous la direction de Gérald Gregori, Michel Denis
Thèse soutenue le 26 février 2010: Aix Marseille 2
Dans l'océan, la respiration microbienne est considérée comme le principal processus représentatif de l’oxydation biologique de la matière organique. La production correspondante de CO2 métabolique a été estimée à environ 22 Pg C a-1. Cependant, les intensités respiratoires qui se déroulent in situ sont généralement trop faibles (de plusieurs ordres de grandeur) pour être accessibles aux méthodes de mesure directes actuellement disponibles. Certaines sondes fluorescentes, comme le DiOC6(3) (Molecular Probes, USA) se sont révélées être très sensibles à l’intensité de la différence de potentiel électrochimique du proton (?µH+), qui caractérise les membranes mitochondriales et plasmiques qui portent le système respiratoire chez les cellules eucaryotes et procaryotes. Chez les mitochondries, le ?µH+ présente une relation linéaire avec le flux d'oxygène. À notre connaissance, aucune relation de ce type n'avait été établie dans le cas de cellules entières marines (micro-organismes). Lors de travaux antérieurs, G. Grégori s’est intéressé à la vitesse de respiration à l’obscurité d’une culture monospécifique de la Chlorophyceae Dunaliella tertiolecta (Butcher) en utilisant un oxygraphe à haute résolution (Oroboros) et une coloration des cellules par le DiOC6(3). Une relation linéaire a été mise en évidence et standardisée, entre la vitesse d’absorption d'oxygène par D. tertiolecta et son intensité de fluorescence verte spécifique induite par le DiOC6(3), permettant ainsi la mesure par cytométrie de flux de la vitesse de respiration de D. tertiolecta. L'étape suivante consiste à étendre la méthode aux procaryotes hétérotrophes, principaux responsables de la minéralisation de la matière organique dans l'océan. Dans le présent travail sont présentés les résultats obtenus sur l’eubactérie Pseudomonas nautica 617, une souche qui a été isolée dans notre laboratoire par P. Bonin en 1987.
-Procaryotes hétérotrophes
-Respiration
-Minéralisation
-Cytométrie en flux
In the Ocean, microbial respiration is considered as the major process representative of the organic matter biological oxidation. The corresponding metabolic CO2 production was estimated to be about 22 Pg C y–1. However, the in situ respiration rate is generally too low (by several orders of magnitude) to be accessible to the available direct measurement methods. Some fluorescent probes, such as DiOC6(3) (Molecular Probes, USA) have been shown to be very sensitive to changes in the proton electrochemical potential difference (?µH+), characterising mitochondrial and plasmic membranes bearing the cell respiratory system in eukaryotic and prokaryotic cells. In mitochondria, ?µH+ is linked to the flux of oxygen uptake by a linear relationship. To our knowledge, no such relationship has been established in the case of whole marine cells. In a previous works, G. Grégori addressed the dark respiration rate of the Chlorophyceae Dunaliella tertiolecta (Butcher) in axenic culture, both directly by using a highly sensitive oxygraph (Oroboros) and by staining cells with DiOC6(3). A linear relationship was established and standardized between the oxygen uptake by D. tertiolecta and its green fluorescence induced by DiOC6(3), enabling the measure by flow cytometry of the respiration rate of D. tertiolecta. The next step is to extend the method to heterotrophic prokaryotes which are responsible for most of the mineralization of the organic matter in the ocean. In the present work are presented results obtained on the eubacteria Pseudomonas nautica 617, a strain that has been isolated in our laboratory by P. Bonin in 1987.
-Heterotrophic
-Respiration
-Mineralization
-Flow cytometry
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22009/document

Sujets

• Respiration
• Minéralisation
• Cytométrie en flux

Informations

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• Nombre de lectures: 279
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 107 Mo

Extrait

Thèse de Doctorat
Présentée par
Lounis MEBAREK
Pour l’obtention du titre de
Docteur en Sciences de l’Environnement
de l’Université de la Méditerranée, Aix Marseille II
Spécialité : Océanologie
Développement d’une approche originale de mesure
directe de la respiration de Pseudomonas nautica à
l’échelle cellulaire par cytométrie en flux
Dr. Marc BOUVY (Examinateur) Université de Montpellier
Dr. Raffaella CASOTTI (Rapporteur) Station Zoologique A. Dohrn (Italie)
Dr. Michel DENIS (Co-Directeur de thèse) Université de la Méditerranée
Dr. Gérald GREGORI (Directeur de thèse) Université de la Méditerranée
Dr. Sami MAALEJ (Rapporteur) Université de Sfax (Tunisie)
Dr. Evelyne NEAU (Examinateur) Université de la Méditerranée
Dr. Richard SEMPERE (Président du Jury) Université de la Méditerranée
Février 2010
2Remerciements
Ce travail n’aurait pu être possible sans le soutien du Conseil Régional
PACA et de l’Université de la Méditerranée.
Les recherches qui ont abouti à la rédaction du manuscrit de thèse ont été
effectuées au Centre d’Océanologie de Marseille (COM), au sein du Laboratoire
de Microbiologie, Géochimie, et Ecologie Marines (LMGEM). Je remercie
vivement les directeurs respectifs, le Professeur Ivan DEKEYSER et le Docteur
Richard SEMPERE, pour leur soutien et leur disponibilité.
Mes remerciements vont aussi au Docteur Patricia BONIN, Responsable de
l’équipe 2 du LMGEM, qui a bien voulu superviser certains de mes travaux.
J’exprime ma profonde reconnaissance à mes directeurs de thèse, le
Docteur Michel DENIS et le Docteur Gérald GREGORI, pour leur bienveillance à
mon égard, pour leur investissement, pour l’intérêt constant qu’ils ont manifesté
tout au long de ce travail, ainsi que pour les conseils et les encouragements qu’ils
n’ont cessé de me prodiguer depuis mon arrivée dans leur équipe.
C’est avec un grand plaisir que je remercie tous les membres de l’équipe 2
du LMGEM pour leurs conseils scientifiques et techniques ainsi que pour leur
amitié.
J’associe également à mes remerciements tous ceux, de France et
d’Algérie, qui de part leur présence, leur disponibilité et leur amitié, m’ont exprimé
leur soutien.
Une pensée particulière à tous ceux qui nous ont quitté récemment.
3« La science consiste à passer d'un étonnement à un autre ».
Aristote
« L'observation scientifique est toujours une observation polémique »
Gaston Bachlard
.
4Sommaire
INTRODUCTION.............................................................................................................................. 16
1. CONTEXTE SCIENTIFIQUE ....................................................................................................... 17
2. LA RESPIRATION DANS L’OCEAN .......................................................................................... 29
2.1. VARIABILITE SPATIOTEMPORELLE DE LA RESPIRATION DANS L’OCEAN ......................................... 32
3. LES PROCARYOTES HETEROTROPHES DANS L’OCEAN ................................................... 33
3.1. VARIABILITE ET HETEROGENEITE DE LA DISTRIBUTION DES PROCARYOTES HETEROTROPHES DANS
L’OCEAN ........................................................................................................................................ 34
3.2. LA PRODUCTION ET LA PERIODICITE DE L’ACTIVITE BACTERIENNE DANS L’OCEAN ........................ 37
3.3. ACTION DES BACTERIES HETEROTROPHES DANS LE FLUX DE MATIERES ET D’ENERGIE DU RESEAU
TROPHIQUE MICROPLANCTONIQUE................................................................................................... 38
3.3.1. Les effets de la prédation sur les bactéries et les flux de matières .............................. 42
4. LA RESPIRATION BACTERIENNE............................................................................................ 44
4.1. VUE GENERALE DU METABOLISME BACTERIEN ........................................................................... 44
4.2. LE CYCLE DE KREBS, ELEMENT CLE DE LA RESPIRATION AEROBIE............................................... 50
4.3. LA RESPIRATION AEROBIE ELEMENT DE REGULATION DU CYCLE DE L’ACIDE CITRIQUE .................. 53
5. OBJECTIF DE LA THESE........................................................................................................... 57
CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES................................................................................. 58
1. LA SOUCHE BACTERIENNE MODELE PSEUDOMONAS NAUTICA 617 .............................. 59
2. LES PRODUITS CHIMIQUES ..................................................................................................... 63
2.1. LE FLUOROCHROME DIHEXYLOXACARBOCYANINE IODIDE (DIOC (3))......................................... 636
2.2. LE DECOUPLEUR CARBOXYL CYANIDE M-CHLOROPHENYLHYDRAZONE (CCCP) ........................... 69
®2.3. LE COLORANT DES ACIDES NUCLEIQUE SYBR GREEN II........................................................... 72
2.4. LE COLORANT DES ACIDES NUCLEIQUES L’IODURE DE PROPIDIUM (PI) ........................................ 73
3. LES INSTRUMENTS ................................................................................................................... 74
3.1. LE CYTOMETRE EN FLUX CYTORON ABSOLUTE.......................................................................... 74
3.1.1. Description et principe de fonctionnement .................................................................... 75
3.1.2. Affichage des données et calibrage .............................................................................. 78
3.1.3. Traitement des données................................................................................................ 79
®3.2. LE CYTOMETRE ANALYSEUR TRIEUR MOFLO DAKO ................................................................ 80
3.2.1. Description et principe de fonctionnement .................................................................... 80
3.2.2. Affichage des données et calibrage .............................................................................. 84
3.2.3. Traitement des données................................................................................................ 85
3.3. L’ OXYGRAPHE A HAUTE RESOLUTION OROBOROS ................................................................. 86
3.3.1. Description et principe de fonctionnement .................................................................... 87
3.3.2. Calibrage de l’oxygraphe............................................................................................... 90
3.3.3. Mesure du flux d’O ....................................................................................................... 922
3.4. L’ OXYGRAPHE A HAUTE RESOLUTION OROBOROS 2K............................................................ 93
3.4.1. Description et principe de fonctionnement .................................................................... 93
3.4.2. Calibrage de l’oxygraphe............................................................................................... 94
3.4.3. Meure du flux d’O ......................................................................................................... 952
3.5. LES OPTODES.......................................................................................................................... 97
3.5.1. Principe de fonctionnement........................................................................................... 98
3.5.2. La composante optique ............................................................................................... 100
3.5.3. Mesure du flux d’O ..................................................................................................... 1012
5CHAPITRE III : RESULTATS ........................................................................................................ 103
1. OPTIMISATION DES CONDITIONS DE CULTURE DE LA SOUCHE PSEUDOMONAS
NAUTICA ....................................................................................................................................... 106
A PRESENT QUE LES CONDITIONS DE MISE EN CULTURE DE LA SOUCHE SONT
MAITRISEES, LA PROCHAINE ETAPE CONSISTE A OPTIMISER LE PROTOCOLE DE
MARQUAGE PAR LE DIOC (3).................................................................................................... 1196
2. OPTIMISATION DES CONDITIONS D’UTILISATION DU DIOC (3)........................................ 1206
2.1. CINETIQUE DE MARQUAGE PAR LE DIOC (3) DE P.NAUTICA PRELEVEES EN PHASE EXPONENTIELLE6
................................................................................................................................................... 123
3. OPTIMISATION DES CONDITIONS DE STIMULATION DE LA VITESSE DE RESPIRATION
DE PSEUDOMONAS NAUTICA ................................................................................................... 126
3.1. OPTIMISATION DES MESURES DE LA RESPIRATION DE P.NAUTICA, PRELEVEE EN PHASE
EXPONENTIELLE DE CROISSANCE, A L’ECH