Effet de l'environnement sur la croissance et l'accumulation de métabolites secondaires chez Datura innoxia Mill. cultivé en conditions hors sol ; impact des facteurs biotiques et abiotiques, Effects of biotic and abiotic environmental parameters for Datura innoxia Mill. tropane alkaloid in soilless cultures

Thi Dao Vu

Description

Sous la direction de Eric Gontier, Frédéric Bourgaud
Thèse soutenue le 04 juillet 2008: INPL
Datura innoxia Mill., une plante de la famille des Solanacées synthétisant des métabolites secondaires, dont les alcaloïdes tropaniques, a été utilisée comme modèle pour cette étude portant sur les cultures en hydroponie. Nous avons déterminé et hiérarchisé les paramètres environnementaux (biotiques et abiotiques) permettant d’améliorer croissance et production de métabolites. La réponse de la plante dépend de l’approvisionnement en oxygène de la solution nutritive, de la température perçue tant niveau des parties aériennes qu’au niveau racinaire. Une augmentation de l’intensité d’éclairage n’améliore pas la teneur en alcaloïdes de la plante mais l’utilisation de lumière orange engendre un changement des paramètres de croissance et des teneurs en molécules recherchées. Nous avons également montré que la présence de microflore dans le milieu de culture provoque une dégradation des molécules d’intérêt et altère leur accumulation dans la plante. Par contre, A. rhizogenes a un effet favorable sur la croissance de la biomasse et la biosynthèse d’alcaloïdes tropaniques dans la plante. L’état transgénique des racines, issues de co-culture hydroponique de Datura innoxia avec A. rhizogenes TR7, a été estimé par une vérification précoce et confirmé par des analyses moléculaires. Nous avons pu mettre en évidence les modifications du phénotype racinaire et les mécanismes d'interaction plante-microorganisme. L’inoculation des agrobactéries peut donner lieu à des transferts naturels de gènes induisant ainsi l’obtention d’un pool racinaire chimérique regroupant des racines normales et des racines transformées. Ces travaux ont ouvert de nouvelles perspectives en vue de déterminer la capacité de production de métabolites secondaires par des plantes en culture hors sol, de manière à obtenir une biomasse riche en molécules recherchées
-Datura innoxia Mill.
-Gène rapporteur
-Agrobacterium rhizogenes
-Culture hors sol
-Scopolamine
-Hyoscyamine
-Alcaloïdes tropaniques
Datura innoxia Mill. a plant species belonging to Solanaceous family, produces hyoscyamine and scopolamine as two main tropane alkaloids. It has been studied in the present work for the development of hydroponic based secondary metabolites bioproduction. More specifically, biotic and abiotic environmental factors have been analysed in order to improve growth and alkaloid accumulation in plant tissues. Oxygen concentration in the nutrient solution is proved to be important for both biomass and compound production in temporary immersion culture conditions occur as one optimum. Temperature has also a major effect, directly and most probably through oxygen solubility and root needs. We showed that artificial light may positively complete natural one but the kind of spectrum must be chosen carefully. From this point of view, orange light from High Pressure Natrium Vapour light showed better results than classical white light. Nitrogen (NO3-15mM) and pH (5 to 6) management may lead to culture optimization. We also show that well chosen wild Agrobacterium rhizogenes strains may be added to the hydroponic nutrient solution in order to improve growth and alkaloid bioproduction. This result is due to the multi occurrence of genetic transformation events. Our results lead to a first classification for impacts of biotic and abiotic factors. It opens new window for plant milking technology industrial development
-Datura innoxia Mill.
-Rapporter gene
-Agrobacterium rhizogenes
-Soil less culture
-Tropane alkaloids
-Hyoscyamine
-Scopolamine
Source: http://www.theses.fr/2008INPL029N/document

Sujets

• Gène rapporteur
• Agrobacterium rhizogenes

Informations

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• Poids de l'ouvrage: 18 Mo

Extrait

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Ecole Doctorale Sciences et Ingénierie des Ressources
Procédés Produits Environnement
INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
ECOLE NATIONALE SUPERIEURE D’AGRONOMIE ET DES INDUSTRIES ALIMENTAIRES


Thèse
Pour obtenir le grade de

Docteur de l’INPL
en Sciences Agronomiques
Présentée et soutenue publiquement par



VU Thi Dao
Le 04 Juillet 2008


Effets de l'environnement sur la croissance et l'accumulation
de métabolites secondaires chez Datura innoxia Mill. cultivé en
conditions hors sol ; impact des facteurs biotiques et abiotiques.


Directeur de thèse : Prof. GONTIER Eric


Composition du jury :

Mme. LAURAIN-MATTAR Dominique : Prof. à la Faculté de pharmacie, Nancy Rapporteur
Mme. BOITEL-CONTI Michèle : MDC-HDR à l’UPJV d’Amiens Rapporteur
M. GUCKERT Armand : Prof. émérite à l’ENSAIA-INPL de Nancy Président
M. SCHALLER Hubert : Chargé de Recherche, CNRS-IBMP de Strasbourg Examinateur
M. BOURGAUD Frédéric : Prof. à l’ENSAIA-INPL de Nancy Examinateur
M. GONTIER Eric : Prof. à l’Université de Picardie Jules Verne d’Amiens Examinateur
REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé au laboratoire UMR Agronomie et Environnement (LAE)-INRA/INPL, de l’Ecole Nationale Supérieure
d’Agronomie et des Industries Alimentaires – Institut National Polytechnique de Lorraine, Nancy et au laboratoire
Androgenèse et Biotechnologie (AEB) de l’Université Picardie et Jules Verne, Amiens.
Avant de présenter ce mémoire, j’aimerai remercier tous ceux qui ont contribué à sa réalisation.
En premier lieu, je voudrais dire combien je suis particulièrement reconnaissante au Prof. Eric GONTIER, mon directeur de
thèse, de m’avoir accordé sa confiance en m’acceptant pour travailler sur ce sujet avec lui. Il a suivi mes travaux avec intérêt
tout en me prodiguant des conseils toujours justes. Et il a su me redonner courage et aider à traverser des moments difficiles
et des instants de doute. Je tiens tout particulièrement à le remercier profondément pour son aide appréciable, sa
gentillesse, sa grande disponibilité et sa compréhension. Je le remercie également pour m’être venu en aide en acceptant
de financer les derniers mois de thèse.
Je remercie monsieur Sylvain PLANTUREUX, Prof. et directeur de LAE à l’ENSAIA et madame Brigitte SANGWAN-
NORREEL, Prof. et directeur de AEB à l’UPJV, qui m’ont accueillie dans leurs équipes de recherche.
Je remercie vivement monsieur Prof. Armand GUCKERT et monsieur Prof. Frédéric BOURGAUD à l’ENSAIA/INPL, les co-
directeurs de ma thèse, qui m’ont aidé à prendre les bonnes directions et m’ont conseillé et encouragé tout au long de la
thèse.
Je tiens à remercier Mme Prof. Dominique LAURAIN-MATTAR et Mme MDC-HDR BOITEL-CONTI Michèle qui ont bien
voulu accepter de juger ce travail en tant que rapporteurs de thèse. J’exprime aussi ma profonde reconnaissance aux
professeurs Armand GUCKERT, Hubert SCHALLER, Frédéric BOURGAUD et Eric GONTIER, membres du jury de thèse.
Je souhaite exprimer toute ma gratitude à Alain HEHN qui m’a guidée dans le contrôle de l’état transgénique du matériel
végétal. Avec sa disponibilité, sa patience et sa connaissance du monde de la biologie moléculaire, il m’a aidée à
comprendre les enjeux et difficultés de ce travail de recherche.
Je souhaite adresser tous mes remerciements à Mme M. BOITEL-CONTI, M. J-C. LABERCHE, M. C. ROBIN et M. E. NAVA
SAUCEDO, qui ont toujours trouvé le temps pour mener avec moi des discussions très enrichissantes.
Mes remerciements s’adressent également à mesdames : C. LARRIERE, T. OLIVIER, M. POIRET, M. CALLIER, C. RAYON
et à messieurs : D. THIERY, G. VASSEUR. Ils ont fait preuve d’efficacité et de gentillesse pour traiter nos demandes malgré
leur charge de travail.
Mes remerciements vont aussi aux doctorants de LAE : F. BITEAU, C. BENARD, R. KOLLER, S. DOERPER, R. LARBAT, B.
CLEGUE, M. CREGUT et l’ingénieur B. MIGNARD pour leurs aides, leur dévouement et leur gentillesse tout au long de ma
thèse.
Je tiens également à remercier les doctorants de AEB : N. KHODOROVA pour son aide dans le traitement des photos et qui
m’a offert son amitié ; S. LEHRAIKI, H. AL BALKHI, B. MENDOU et R. NASRI pour leur aide durant les deux dernières
années ; les post-doctorants : TLM TRAN, Y. HUET pour leurs conseilles et aides durant mes dernières expériences, et
enfin, C. JOUSSE pour ses aides et relectures de mon document.
Ma gratitude va aussi à tous les stagiaires, techniciens, chercheurs et enseignants-chercheurs appartenant aux laboratoires
de Nancy et d’Amiens pour leur accueil sympathique ; qui m’ont fait part de leur passion de recherche, et n’ont pas hésité à
consacrer du temps à répondre mes questions.
Mes remerciements s’adressent aux docteurs : H. DE BON (CIRAD de Montpellier) pour l’aide qu’il m’a apporté pour ma
venue en France et J. LE BOT pour m’avoir initié à la recherche au sein d’un laboratoire français à l’unité Plantes et
Systèmes de Cultures Horticoles de l’INRA d’Avignon ; aux messieurs directeurs : J-F LEFEVRE - responsable de
plateforme régionale de Picardie pour son autorisation de travailler dans son local, J-P FEVRE de la société de PAT SAT et
R. SANGWAN de CNRS qui m’ont encouragé au cours de ma thèse.
Cette étude n’aurait pu se réaliser sans l’apport du gouvernement de mon pays le Viet Nam qui m’a alloué une bourse
d’étude, et plus particulièrement l’ensemble du personnel du Projet 322. Qu’il retrouve ici toute ma reconnaissance et mes
plus vifs remerciements.
Je ne terminerai pas mes remerciements sans une pensée pour ma famille, et ma petite Dieu Huong, à qui je dois un
soutien tant moral qu’affectif et qui ont su m’entourer tout au long de ce travail, un soutien qui va bien au-delà de ce que je
pourrais exprimer.
Encore merci à tous !
2
LEXIQUE/ABREVIATION

%MS : pourcentage de matière sèche
°C : degré Celsius
μM : micromolaire
μS/cm ou mS/cm : microSiemens/cm ou milliSiemens/cm
A.r. : Agrobacterium rhizogenes
ADN : acide désoxyribonucléique
ADN-T : Acide DéoxyriboNucléique de Transfert
AIA : acide indole acétique
ARN : acide ribonucléique
BET : bromure d’ethidium
BF : biomasse fraîche
BS : biomasse sèche
CLHP : chromatographie liquide haute performance (cf. HPLC)
CPG : chromatographie en phase gazeuse (cf. GC)
DMSO : Dimethyl Sulfoxide (C H OS) 2 6
DO : densité optique
2
DPI : Dots Per Inch (pixels par pouce). Nombre de pixels sur 2.54 cm (pouce anglais),
permettant d'exprimer la résolution d'une image. Une image affichée sur un écran est de
72dpi, une image destinée à l'impression est généralement de 300dpi.
EDTA : Acide Ethylène Diamine Tétra Acétique
egfp : gène codant la protéine verte fluorescente modifiée
ENSAIA : Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires
GFP : green fluorescent protein - protéine verte fluorescente d’Aequorea victoria
gus : gène codant pour l’enzyme de β-glucuronidase
H : hyoscyamine (289g/mol)
H&S: hyoscyamine + scopolamine
H6H : hyoscyamine-6β-hydroxylase
Homa : homatropine (275g/mol)
HPLC : chromatographie liquide haute performance (cf. CLHP)
INRA : Institut National de la Recherche Agronomique
IUPAC: International Union for Pure and Applied Chemistry
Kb : kilo de base égale 1000 pb
m : mètre
M : molaire, mM : milimolaire
MeJa : Méthyle Jasmonate
MII : métabolites secondaires
MS : solution nutritive de Murashige et Skoog
mS/cm : milliSiemens/cm
3
NS : non significatif (utilisé pour les différen