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Effets des ligands de PPAR? sur la voie de signalisation des oestrogènes dans les cellules cancéreuses mammaires, Effects of the PPAR? ligands on estrogens signaling pathway in breast cancer cells

De
354 pages
Sous la direction de Stéphane Flament
Thèse soutenue le 02 février 2009: Nancy 1
Le récepteur alpha des œstrogènes (ERa) est une cible privilégiée dans le traitement du cancer du sein. En effet, 70% des tumeurs sont hormono-dépendantes, c’est-à-dire qu’elles expriment ERa et que les œstrogènes contrôlent leur prolifération. Par ailleurs, les agonistes du récepteur nucléaire « Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma » (PPAR?? inhibent la prolifération des cellules cancéreuses mammaires in vivo et in vitro. L’objectif de la thèse visait à déterminer si ces composés, en particulier ceux de la famille des thiazolidinediones, interféraient avec la voie de signalisation des œstrogènes. Les travaux ont porté sur 2 lignées cancéreuses mammaires hormono-dépendantes : MCF-7 et ZR-75-1. La troglitazone (TGZ), la ciglitazone et la 15déoxy-Prostaglandine J2 (15d-PGJ2) altèrent la signalisation œstrogénique en induisant la dégradation de l’ERa. ?Cette protéolyse fait appel au protéasome 26S et elle est plus accentuée pour la lignée ZR-75-1. Les composés qui altèrent la signalisation œstrogénique inhibent aussi fortement la prolifération cellulaire. La dégradation de ERa ne semble pas dépendre de l’activation des ligands de PPAR? puisqu’un agoniste puissant comme la rosiglitazone n’induit pas cet effet. L’utilisation d’antagonistes de PPAR?, de la ?2-TGZ, dérivé de la troglitazone qui n’active pas PPAR? ainsi qu’une approche par interférence ARN ont permis de démontrer que la protéolyse de l’ERa est bien liée à mécanisme indépendant de PPAR?. La littérature indiquait que la 15d-PGJ2 se liait de façon covalente à ERa, ?mais pas à l’isoforme ERß. Nous avons observé que la 15d-PGJ2 n’induisait pas la protéolyse de ERß. Une dégradation différentielle a aussi été observée avec les thiazolidinediones. En outre, l’activité transcriptionnelle de ERa est affectée précocement après l’exposition des cellules aux différents ligands, suggérant une modification du récepteur. Afin de savoir si une liaison covalente pouvait être à l’origine de la protéolyse, un groupement biotine a été greffé sur la ?2-TGZ afin de réaliser des expériences de pull-down. Ce composé n’a pas permis de démontrer l’hypothèse mais cette molécule induit plus efficacement que la molécule d’origine la protéolyse non seulement de l’ERa, ?mais aussi de la cycline D1. Des modifications des ligands de PPAR? ?pourraient donc avantageusement diminuer les doses efficaces. Ces mécanismes PPAR?-indépendants, qui aboutissent à la dégradation de la cycline D1 et de ERa mais pas de ERß pourraient être intéressants dans l’optique d’une application à la thérapeutique des cancers mammaires.
-MCF-7
-ERa
Estrogen receptor alpha (ERa) is a major target in breast cancer treatment. About 70% of breast cancers are estrogen-sensitive meaning that estrogens stimulate their growth. Ligands of PPAR? (Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma) inhibit breast cancer cell proliferation both in vivo and in vitro. The aim of this work was to determine whether PPAR? ligands could interfere with estrogen signalling pathway. The effects of Rosiglitazone (RGZ), Ciglitazone (CGZ), Troglitazone (TGZ) and the natural PPAR? agonist 15d-PGJ2 were investigated in two hormone-dependent breast cancer cell lines, MCF-7 and ZR-75-1. In both of them, TGZ, CGZ and 15d-PGJ2 induced an inhibition of ERa signalling associated with the proteasomal degradation of ERa. ZR-75-1 cells were more sensitive than MCF-7 to these compounds. Treatments that induced ERa degradation also inhibited cell proliferation after 24h. In contrast, 24h exposure to RGZ, the most potent activator of PPAR? disrupted neither ERa signalling nor cell proliferation. 9-cis retinoic acid never potentiated the proteasomal degradation of ERa. PPAR? antagonists did not block the proteolysis of ERa in MCF-7 and ZR-75-1 cells treated with TGZ. ERa proteolysis still occurred in case of PPAR? silencing as well as in case of treatment with the PPAR?-inactive compound ?2-TGZ, demonstrating a PPAR?-independent mechanism. A previous study indicated that 15d-PGJ2 was able to covalently modify ERa, ?but did not bind to ERß. First, we observed that in contrast to ERa, ERß proteolysis did not occur in MCF-7 cells exposed to 15d-PGJ2. A differential proteolysis was also observed in case of exposure to thiazolidinediones. Moreover, transfection experiments using pEREtkLuc showed that ERa functionality was affected early after exposure of MCF-7 cells to thiazolidinediones. In order to determine if a covalent binding of PPAR? ligands to ERa ?could lead to its proteolysis, a biotinylated derivative of ?2-TGZ was synthesized. However, pull-down assays performed using neutravidin beads did not allow to demonstrate a covalent interaction between ERa and biotinylated ?2-TGZ. When we verified the efficiency of biotinylated ?2-TGZ on ERa ?proteolysis induction, we observed that the substitution by biotine potentiated the TGZ-induced proteasomal degradation not only of ERa but also of cyclin D1. In conclusion, the design of new thiazolidinedione derivatives could lead to more efficient molecules able to affect differentially ER in a PPAR?-independent way and could be an interesting tool for breast cancer therapy.
Source: http://www.theses.fr/2009NAN10009/document
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,,\UM'."i"
Ho." PO"C.,' FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES
UFR Sciences et Techniques Biologiques
Ecole doctorale Biologie, Santé, Environnement



Thèse
Présentée pour l’obtention du titre de
Docteur de l’Université Henri Poincaré, Nancy-I
En Biologie Cellulaire

Par Julie LECOMTE
EFFETS DES LIGANDS DE PPAR γ SUR LA VOIE DE
SIGNALISATION DES OESTROGENES DANS LES
CELLULES CANCEREUSES MAMMAIRES
Soutenance publique prévue le 2 Février 2009 devant la commission d’examen
Membres du jury :
Rapporteurs : Mme Marie-Christine Rio (Docteur, Responsable du Laboratoire de Biologie Cellulaire du
Cancer du Sein, IGBMC, Illkirch)
Mme Irmgard Irminger-Finger (Docteur, Responsable du Laboratoire de Gynécologie-
Obstétrique Moléculaire, Hôpitaux Universitaires, Genève)

Examinateurs : Mme Martine Duterque-Coquillaud (Chargée de recherche, CNRS, Lille)
Mr Marc Diederich (Docteur, LBMCC, Luxembourg)
Mme Isabelle Grillier-Vuissoz (Docteur, Co-directrice de thèse, UHP, Nancy Université)
Mr Stéphane Flament (Professeur, Directeur de thèse, UHP, Nancy Université)

EA 3442 Aspects cellulaires et moléculaires de la reproduction et du développement – Faculté des Sciences
et Techniques – Boulevard des Aiguillettes BP239 – 54506 Vandoeuvre – lès – Nancy - France LISTE DES ABREVIATIONS

12,1415d-PGJ : 15-deoxy-Δ -Prostaglandine J2 2
ACTR : activateur des récepteurs de l’hormone thyroïdiennes et de l’acide rétinoïque
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ADNc : Acide DésoxyriboNucléique complémentaire
AF : Activating function
AIB: Amplified In Breast cancer
AINS : Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens
AJCC : American Joint Committee on Cancer
AMPc : Adénosine MonoPhosphate cyclique
AP : Activating Protein
ARNm : Acise RiboNucléique messager
BADGE : Bisphenol Acid Diglycide Ether
CARM-1 : Coactivator-asociated Arginine Methyltransferase 1
CDDO: 2-Cyano-3, 12-Dioxoolean-1, 9-Dien-28-Oic acid
cdk: cyclin-dependent kinase
CGZ : ciglitazone
ChIP: Chromatin ImmunoPrecipitation
CHIP : carboxyl terminus of HSC70-interacting protein
COX : Cyclooxygenase
CREB: cAMP Responsive Element Binding Protein
DBD : DNA Binding Domain
DDT : DichloroDiphénylTrichloroéthane
DRIP 205: Vitamin D Receptor Interacting Protein
E1: œstrone
E2: 17β- œstradiol
E3: œstriol
EGF : Epidermal Growth Factor
EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor
EGR-1: Early Growth Response-1
ER : Estrogen Receptor
ERBF-1 : Estrogen Receptor promoter B associated Factor 1
ERE : Estrogen Response Element
ERF1 : Eukaryotic Release Factor 1
ERR : Estrogen Related Receptor
ERα : Estrogen Receptor α
ERβ : Estrogen Receptor β
FGF : Fibroblast Growth Factor FSH : Follicle-Stimulating Hormone
GPR30: G protein-coupled receptor 30
GRIP1 :Glucocorticoid receptor interacting protein 1
HDCA:Histone DeaCetylAse
HETE : acide hydroxyeicosatétraénoique
HODE : acide hydroxyoctadécadiénoique
Hsp : Heat Shock Protein
ICAM : InterCellular Adhesion Molecule
IGF : Insulin like Growth Factor
Kd : constante de dissociation
KDa : KiloDalton
LBD : Ligand Binding Domain
LH-RH : Luteinizing Hormone-Releasing Hormone
MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase
MMP : Matrix Metalloprotease
N-CoA 1/2: co-activateur 1/2 du récepteur nucléaire
NCoR : Nuclear receptor CoRepressor
NF-κB: Nuclear Factor kappa B
NPM1 : NucleoPhosMin 1
p/CIP : protéine I associée à CBP/p300
PCB : Polychloro Biphényls
PDGFβ : Platelet-derived growth factor
PGZ :pioglitazone
PI3K/Akt : PhosphoInositol-3-Kinase/Akt
PKA: protéine kinase A
PKC : protéine kinase C
PPAR: peroxisome proliferator-activated receptor
PPRE : PPAR-responsive element
PR : Progesterone Receptor
pRb : protéine du retinoblastoma
PRIP: PPAR gamma-interacting protein
PTEN: Phosphatase and TENsin homolog
RAC3 : Receptor Associated Co-activator 3
RAP 250 : nuclear Receptor-Activating Protein 250
RAR : Retinoic Acid Receptor
REA : Repressor of Estrogen receptor Activity
RGZ :rosiglitazone
RPF-1 : Receptor potentiating factor 1
RXR : Retinoid X Receptor
SAHA : SuberoylAnilide Hydroxamic Acid SAP30: Sin3A-sin-associated polypeptide 30 kDa
SERM: Selective Estrogen Receptor Modulator
SH2 : Src Homology domain
SHBG: Sex Hormone Binding Globulin
SMRT : Silencing Mediator for Retinoic acid receptor and Thyroid hormone receptor
Sp-1 : GC-box Binding Protein
SPARMγ : Selective PPAR Modulators γ
SRA : steroid receptor RNA activator
Src : avian sarcoma vius
SRC: Steroid Receptor Coactivator
SUMO: Small Ubiquitin like Modifiers
TGF : Transforming Growth Factor
TGZ : troglitazone
TIF 2: Transcriptional Intermediary Factor
TIMP-1 : Tissue Inhibitor of MetalloProteinases 1
TNM : Tumor Node Metastases
TRAIL: Tumor necrosis factor-alpha (TNF)-Related Apoptosis-Inducing Ligand
TRAM-1 : Thyroid receptor activating molecule
TRAP 220: Thyroid Hormone Receptor-associated Protein
TRBP: Thyroid hormone Receptor-Binding Protein
TZD : ThiaZolidineDione
UICC : Union Internationale Contre le Cancer
UTR : UnTranslated Region
VCAM : Vascular Cell Adhesion Molecule-1
VDR : Vitamin D Receptor VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor SOMMAIRE

CHAPITRE I : INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE

PARTIE I : LE CANCER DU SEIN 1
I. Le sein normal : architecture et développement 1
1.1. Architecture 1
1.2. Développement 1
II. Le cancer du sein 2
2.1. Mécanisme de déclenchement tumoral 2
2.2. Développement tumorale, invasion et métastases 5
2.2.1. Croissance de la tumeur 6
2.2.2. Angiogenèse 6
2.2.3. Invasion tumorale et métastase 7
2.3. Anatomie pathologique des cancers du sein 8
2.3.1. Classification clinique 8
2.3.2. histologique 9
III. Incidence, facteurs de risque, facteurs de survie 10
3.1. Incidence 10
3.2. Facteurs de risque 10
3.2.1. Facteurs génétique 10
3.2.2. environnementaux 11
3.2.3. Facteurs hormonaux 12
3.2.3.1. Hormones endogènes 12
3.2.3.2. exogènes 13
3.3. Facteurs pronostiques et survie 14
IV. Stratégies thérapeutiques 15
4.1. Chirurgie 15
4.2. Radiothérapie 15
4.3. Chimiothérapie 15
4.4. Hormonothérapie 16
4.4.1. Hormonothérapie soustractive 16
4.4.2. Hormadditive 16
4.4.3. Horminhibitrice 17