Establishment of a systematised approach for the development of novel diagnostics and therapeutics in the field of biotechnology [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Petra Schumacher

Description

EstablishmentofasystematisedapproachforthedevelopmentofnoveldiagnosticsandtherapeuticsintheeldofbiotechnologyVonderFakultätfürMathematik,InformatikundNaturwissenschaftenderRheinisch-WestfälischenTechnischenHochschuleAachenzurErlangungdesakademischenGradeseinerDoktorinderNaturwissenschaftengenehmigteDissertationvorgelegtvonDiplomBiologinPetraSchumacherausBadHonnefBerichter:Universitätsprofessor Dr. R.FischerUniversitätsprofessor Dr. F.KreuzalerTagderm ndlichenPrüfung: 26.06.2006DieseDissertationistaufdenInternetseitenderHochschulbibliothekonlineverfügbar.CurriculumVitaePersonalDataName: PetraSchumacherBirth: 12. August1977inBadHonnef,GermanyNationality: germanMaritalstatus: unmarriedSchoolEducation08/1988-06/1997 WiedtalGymnasiumNeustadt/Wied,Germany06/1997 Final secondary-school examinations (Abitur)(Grade: 1.6)University10/1997-09/2002 Study of Biology at the University of Aachen(RWTHAachen),Germany01/2002-09/2002 Diploma thesis at the Institute for MolecularBiotechnology-RWTHAachen,GermanyunderdirectionofProf. Dr. R.FischerDissertation10/2002-10/2005 Doctoral thesis at the Institute for MolecularBiotechnology-RWTHAachen,GermanyunderdirectionofProf. Dr. R.FischerContents1 Introduction 11.1 DemandofNovelDiagnosticsandTherapeutics . . . . . . . . . . . . . . 11.2 Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.3 GenerationofAntibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.3.

Sujets

• Gesundheit

Informations

• Publié par: rheinisch-westfalischen_technischen_hochschule_-rwth-_aachen
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 9
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 2 Mo

Extrait

Establishmentofasystematisedapproachforthe
developmentofnoveldiagnosticsandtherapeuticsinthe
eldofbiotechnology
VonderFakult?tf?rMathematik,InformatikundNaturwissenschaftender
Rheinisch-Westf?lischenTechnischenHochschuleAachenzurErlangungdes
akademischenGradeseinerDoktorinderNaturwissenschaftengenehmigte
Dissertation
vorgelegtvon
DiplomBiologin
PetraSchumacher
ausBadHonnef
Berichter:
Universit?tsprofessor Dr. R.Fischer
Universit?tsprofessor Dr. F.Kreuzaler
Tagderm ndlichenPr?fung: 26.06.2006
DieseDissertationistaufdenInternetseitenderHochschulbibliothekonline
verf?gbar.CurriculumVitae
PersonalData
Name: PetraSchumacher
Birth: 12. August1977inBadHonnef,Germany
Nationality: german
Maritalstatus: unmarried
SchoolEducation
08/1988-06/1997 WiedtalGymnasiumNeustadt/Wied,Germany
06/1997 Final secondary-school examinations (Abitur)
(Grade: 1.6)
University
10/1997-09/2002 Study of Biology at the University of Aachen
(RWTHAachen),Germany
01/2002-09/2002 Diploma thesis at the Institute for Molecular
Biotechnology-RWTHAachen,Germany
underdirectionofProf. Dr. R.Fischer
Dissertation
10/2002-10/2005 Doctoral thesis at the Institute for Molecular
Biotechnology-RWTHAachen,Germany
underdirectionofProf. Dr. R.FischerContents
1 Introduction 1
1.1 DemandofNovelDiagnosticsandTherapeutics . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3 GenerationofAntibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3.1 HybridomaTechnology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3.2 PhageDisplayTechnology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4 Antigens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.4.1 EstrogensandXenoestrogens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.4.2 LungCancer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.4.3 PancreasandPancreaticCancer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.5 Objectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.5.1 AGESSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.5.2 Systemised ApproachforHigh-Throughput GenerationofAnti-
bodiesandIdenti cationoftheCorrespondingAntigens . . . . . 19
2 MaterialandMethods 22
2.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.1.1 ChemicalsandConsumables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.1.2 Media,StocksolutionsandBuffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.1.2.1 GeneralRecipes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.1.2.2 MediaforCultivationofMammalianCells . . . . . . . . 25
2.1.3 DerivativeofNonylphenol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.1.4 EnzymesandReactionKits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.1.5 Primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.1.6 AfnityBeads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.1.7 Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.1.8 PhageandPhageDisplayLibrary . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.1.9 BacterialStrain . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.1.10 MammalianCellLines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.1.11 EquipmentandApplications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.1.12 LaboratoryAnimals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.1.13 ApprobationfortheConductedWork . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2.1 RecombinantDNATechnologies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2.1.1 PolymeraseChainReaction . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.2.1.2 AgaroseGelElectrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . . 33Contents ii
2.2.1.3 RestrictionDigestofDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.2.2 Protein-Chemistry Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.2.2.1 PreparationofCellLysates . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.2.2.2 PreparationofTissueLysates . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.2.2.3 CouplingofNonylphenoltocBSA . . . . . . . . . . . . 34
2.2.2.4 FluorescentLabellingofProteinSolutions . . . . . . . . 34
2.2.3 ImmunisationofMice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.2.4 MammalianCellCultureMethods . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.2.4.1 CulturingofMammalianCells . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.2.4.2 FreezingandThawingofMammalianCells . . . . . . . 37
2.2.4.3 DeterminationofCellNumber . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.2.4.4 ImmortilisationofB-cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.2.4.5 PropagationofSingleCellsandmAb-Production . . . . 38
2.2.5 ProteinAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.2.5.1 Quanti cationofProteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.2.5.2 Two Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(2D-PAGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.2.5.3 SDS-PAAGelElectrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.2.5.4 SilverStainingofProteinsinPAA-Gels . . . . . . . . . . 41
2.2.5.5 WesternBlot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.2.5.6 Enzyme-linkedImmunosorbentAssay(ELISA) . . . . . 42
2.2.5.7 IsotypeDeterminationofMonoclonalAntibodies . . . . 42
2.2.5.8 FlowCytometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.2.5.9 FluorescentActivatedCellSorting(FACS) . . . . . . . . 43
2.2.5.10 Immunoprecipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.2.5.11 MolecularImaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.2.6 MassSpectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.2.6.1 TrypticdigestinSolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.2.6.2 In-Gel-DigestionofProteins . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.2.6.3 MassSpectrometry andDatabaseAnalysis . . . . . . . . 47
2.2.6.4 NP-captureandsubsequentGCMSanalysis . . . . . . . 47
2.2.7 Phage-DisplayMethods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3 Results 50
3.1 GenerationofaNP-speci cAntibody(AGEESA) . . . . . . . . . . . . . . 5 0
3.1.1 CouplingofNPtocBSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.1.2 ImmunisationofMice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.1.3 ImmortalisationofB-cellsandAntigen-speci cSingleCellSorting 54
3.1.4 CharacterisationofmAbsagainstNP . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.1.4.1 ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.1.4.2 ProductionofmAbNP78 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.1.4.3 CharacterisationofmAbNP78 . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.2 Systemised Approach for High-Throughput Generation of Antibodies
andIdenti cationoftheCorrespondingAntigens . . . . . . . . . . . . . 60
3.2.1 PhageDisplayApproach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.2.1.1 UnselectedNa?vescFv-Phagemid-Library . . . . . . . . 61
3.2.1.2 SelectionofNa?vescFv-Phagemid-LibraryonH526cells 62Contents iii
3.2.2 HybridomaApproach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.2.3 ImmunisationofMice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2.4 OptimisationofSpleenCellPreparation . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.2.5 OptimisationofSingleCellCulturing . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.2.6 Immortalisation of Murine B-cells and Antigen Speci c Single
CellSorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
3.2.6.1 H1373I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.2.6.2 HFL1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.2.6.3 CellSortingControls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.2.6.4 H1373-GFP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.2.6.5 PTL2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
3.2.7 MonoclonalAntibodyProduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.2.7.1 AntigenIdenti cation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.2.7.2 MolecularImagingoftheHFL1-22Antigen . . . . . . . 88
4 Discussion 89
4.1 GenerationofaNP-speci cAntibody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.1.1 CouplingofNPtocBSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.1.2 ImmunisationofMicewithNP-cBSA . . . . . . . . . . . . . . . . 91
4.1.3 ImmortalisationofSpleenCellsandFluorescenceActivatedCell
Sorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
4.1.4 CharacterisationofmAb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
4.1.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
4.1.6 Outlook . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.2 Systemised Approach for High-Throughput Generation of Antibodies
andIdenti cationoftheCorrespondingAntigens . . . . . . . . . . . . . 96
4.2.1 PhageDisplayApproach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
4.2.2 HybridomaApproach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
4.2.2.1 ImmunisationofMice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
4.2.2.2 ImmortalisationofMurineB-cellsandAntigenSpeci c
SingleCellSorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
4.2.2.3 MonoclonalAntibodyProduction . . . . . . . . . . . . . 103
4.2.2.4 ImmunoprecipitationandAntigenIdenti cation . . . . 105