Etude de la structure et de la région-spécificité de la m1A57/58 méthyltransférase d'ARNt de l'archée Pyrococcus abyssi, Structural study and insight into the region-specificity of archaeal Pyrococcus abyssi tRNA m1A57/58 methyltransferase

Amandine Guelorget

Description

Sous la direction de Béatrice Golinelli-Pimpaneau
Thèse soutenue le 29 avril 2011: Paris 11
La méthylation de l’adénine en position 58 des ARNt (m1A58) est présente dans les trois domaines de vie et joue un rôle crucial chez plusieurs organismes. Sa formation est catalysée par la méthyltransférase SAM-dépendante TrmI. Alors que chez les eucaryotes et les bactéries, TrmI est site-spécifique pour l’adénine en position 58, chez l’archée Pyrococcus abyssi, TrmI est région-spécifique puisqu’elle catalyse également la méthylation de l’adénine en position 57. Nous nous sommes intéressés à cette enzyme, PabTrmI, pour comprendre cette différence de spécificité par rapport à ses homologues eucaryotes et bactériens.La structure cristallographique de l'enzyme, en complexe avec son cofacteur SAM ainsi qu’avec le produit de la réaction, la SAH, nous a conduit à construire différents mutants de la protéine et de son substrat ARNt. Nous avons ainsi montré que His78, située à l’entrée du site actif, est mobile et est importante pour l’efficacité catalytique de PabTrmI. L’analyse des positions de méthylation par spectrométrie de masse, simple et en tandem, montre qu’une partie de la région-spécificité de l’enzyme pour certains ARNt de P. abyssi, est liée à la présence de trois adénines consécutives, PabTrmI ne méthylant que la première adénine d’une séquence AA.En vue d’étudier les cinétiques rapides du mécanisme de retournement de la base de l’ARNt par l’enzyme région-spécifique PabTrmI et l’enzyme bactérienne site-spécifique TthTrmI de T. thermophilus, nous avons vérifié dans un premier temps, par spectrométrie de masse, qu’un mini-ARNt, constitué de la tige acceptrice et de la tige-boucle T, est substrat de TrmI.
-Enzyme de modification
-TrmI
-M1a58
-Région-spécificité
The methylation of adenine 58 in the T-loop of tRNAs (m1A58) is a modification present in all three domains of life. An important biological role for m1A58 has been demonstrated in different organisms. Its formation is catalyzed by the SAM-dependent methyltransferase TrmI. In contrast to bacterial and eukaryotic tRNA m1A58 methyltransferases that are site-specific, the homologous archaeal enzyme from Pyrococcus abyssi is region-specific, since it catalyzes the formation of m1A also at the adjacent position 57. A structural and biochemical study of this enzyme, PabTrmI, was undertaken to shed light on the origin of the multisite recognition mechanism.First, we determined the crystal structure of PabTrmI in complex with its cofactor SAM and the reaction product SAH. These structures enabled us to construct both protein and tRNA mutants. We show that His78, which lies near the active site, is mobile and important for catalytic efficiency of PabTrmI. The analysis of the méthylation positions, by mass spectrometry, shows that at least part of the enzyme region-specificity for several P. abyssi tRNAs, is related to the presence of three consecutive adenines, with the enzyme modifying the first adenine of an AA sequence.To investigate the mechanism of tRNA base flipping by the region-specific enzyme PabTrmI and the site-specific bacterial enzyme TthTrmI of T. thermophilus, we checked, as a first step, by mass spectrometry, that a mini-tRNA, formed from the acceptor stem and the T-arm, was substrate of TrmI.
-Trna
-Modification enzyme
-Methyltranferase
-TrmI
-M1a58
-Crystallography
-Mass spectrometry
-Region-specificity
Source: http://www.theses.fr/2011PA114807/document

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 61
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 43 Mo

Extrait

Universite Paris-Sud 11
Faculte des Sciences d’Orsay
Ecole Doctorale :
Innovation Therapeutique : Du Fondamental A l’Applique
^ Pole : Ingenierie des Proteines et Cibles Therapeutiques
These de Doctorat
soutenue le 29 avril 2011
par
Amandine GUELORGET
pour obtenir le grade de Docteur en Sciences de l’Universite Paris-Sud 11
Etude de la structure et de la region-speci cite de
1la m A57/58 methyltransferase d’ARNt de
l’archee Pyrococcus abyssi
Directrice de these Beatrice Golinelli-Pimpaneau
Composition du jury Herman Van Tilbeurgh President
Eric Westhof Rapporteur
Christiane Branlant Rapporteur
Dominique Fourmy Examinateur
Carine Tisne Examinateur
Beatrice Golinelli-Pimpaneau Directrice de these
These preparee au Laboratoire d’Enzymologie et Biochimie Structurales
UPR 3082 CNRS - B^ atiment 34
1 avenue de La Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette
tel-00612159, version 1 - 28 Jul 2011tel-00612159, version 1 - 28 Jul 2011Remerciements
Ce travail de these a ete realise dans l’equipe « Enzymes de modication
des ARN de transfert : etude mecanistique et structurale », dirigee par le
Dr. Beatrice Golinelli-Pimpaneau, au sein du Laboratoire d’Enzymologie
et Biochimie Structurales (LEBS) situe sur le campus du CNRS de Gif-sur-
Yvette.
Je tiens a remercier, en premier lieu, Beatrice Golinelli, pour son en-
cadrement pendant ces annees passees dans son equipe, pour l’attention et
la disponibilite dont elle a fait preuve tout au long de mon doctorat, et no-
tamment lors de la redaction de cette these. Tout en me laissant une grande
autonomie, elle a su me guider et m’aider pour faire avancer nos projets. J’ai
beaucoup apprecier son e cacite et sa rigueur lors de notre collaboration dans
l’ecriture de nos articles.
Je remercie Eric Westhof et Christiane Branlant pour avoir accepte
d’^etre rapporteurs de ce travail, et Herman Van Tilbeurgh, Dominique
Fourmy et Carine Tisne, qui m’ont egalement fait l’honneur de faire par-
tie du jury.
Je remercie egalement Sylvie Auxilien pour toute l’aide qu’elle m’a ap-
portee, tant au moment de mon apprentissage que pendant les annees qui ont
suivies. J’ai particulierement apprecie sa grande disponibilite, ses conseils et
sa gentillesse.
Je remercie Djemel Hamdane pour l’aide qu’il m’a apportee sur mes tra-
vaux, mais aussi pour nos discussions scientiques ou non, et surtout sa bonne
humeur et les rires partages.
Je remercie Vincent Guerineau de l’equipe de Spectrometrie de Masse
d’Alain Brunelle, a l’Institut de Chimie des Substances Naturelles, pour sa
collaboration tres fructueuse, sa disponibilite et son accueil toujours tres cha-
leureux lors de mes visites a l’ICSN.
i
tel-00612159, version 1 - 28 Jul 2011ii Remerciements
Je remercie tous mes collegues du LEBS, en particulier les membres de
l’equipe 07, pour m’avoir accueillie si souvent parmi eux a midi. Je tiens a
remercier chaleureusement Olivier et Jeremie pour leur tres grande capacite
d’ecoute, leur non moins grande disponibilite, leur bonne humeur et humour,
et pour tous les bon moments passes ensemble.
Je remercie Lucie Lecouflet, que j’ai eu le plaisir d’encadrer lors de ses
deux stages de BTS, pour sa gaiete et tous les bons moments que nous avons
passer ensemble.
Un grand merci a Ludovic, mon futur mari, pour ses encouragements, son
soutien indefectible et sa patience. Je le remercie d’avoir organise, en grande
partie, notre mariage, pendant que je me concentrais sur la redaction de ma
these.
Je remercie enn toutes les personnes qui m’ont encouragee et soutenue
durant ces trois annees, et notamment mes parents et mes s urs.
tel-00612159, version 1 - 28 Jul 2011Sommaire
Remerciements i
Liste des abreviations xvii
Avant-propos xix
I Introduction 1
1 Les acides ribonucleiques de transfert 3
1.1 Structure des ARNt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.1 Structure primaire des ARNt . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.2 Structure secondaire des ARNt . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.3 Structure tridimensionnelle des ARNt . . . . . . . . . . . 7
1.2 Fonction des ARNt dans la cellule . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2.1 Fonction des ARNt dans la traduction . . . . . . . . . . 10
1.2.2 Autres fonctions des ARNt . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.2.2.1 Les ARNt aminoacyles . . . . . . . . . . . . . . 12
Precurseurs pour la synthese d’autres aa-ARNt. . 12
Donneurs d’acides amines pour la synthese du
pont interpeptidique du peptidoglycane
bacterien. . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Leur ro^le dans la degradation des proteines. . . . 15
Donneur d’acides amines pour la modication des
lipides des membranes bacteriennes. . 16
Intermediaire dans la synthese d’antibiotique. . . 17
Leur r^ole dans la synthese des tetrapyrroles. . . . 17
1.2.2.2 Les ARNt non-aminoacyles . . . . . . . . . . . 18
Regulateurs de l’expression de certains genes. . . . 18
Ro^le catalytique dans les reaction de transpepti-
dation, aminoacylation et desacylation. 18
iii
tel-00612159, version 1 - 28 Jul 2011iv SOMMAIRE
Amorces lors de la replication inverse des retrovirus. 19
1.3 Biosynthese des ARNt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3.1 Maturation des ARNt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.3.2 Modi