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AVERTISSEMENT



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soutenance et mis à disposition de l’ensemble de la communauté
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LIENS




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UNIVERSITE DE NANCY

INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE


N° attribué par la bibliothèque
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THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL
POLYTECHNIQUE DE LORRAINE

Discipline : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires


Présentée et soutenue publiquement par

Mr. Ihsen YOUSSEF

Le 31 Octobre 2006


Titre
Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans la mort neuronale
induite par le peptide β-amyloïde soluble :
Recherche et validation fonctionnelle de cibles cellulaires.



Directeur de thèse : Dr. Brigitte Leininger-Muller


JURY
Pr. François Laurent (président)
Dr Bernadette Allinquant, DR2 Inserm (rapporteur)
Dr. Jean-Paul Fuchs, CR1 CNRS (rapporteur)
Dr. Brigitte Leininger-Muller, MCU
Dr. Thierry Pillot, DR2 Inserm















On vous a dit aussi que la vie est obscurité, et dans votre lassitude vous répétez
ce que disent les las.
Et je vous dis que la vie est en effet obscure sauf là où il y a élan,
Et tout élan est aveugle sauf là où il y a la connaissance.
Et toute connaissance est vaine sauf là où il y a le travail,
Et tout travail est futile sauf là où il y a l'amour ;

Gibran Khalil Gibran.



















A ma mère et mon père

Recevez par l’aboutissement de ce travail la récompense de votre soutien, de
votre patience et de vos prières tout le long de ces années et le témoignage de
mon amour.

A mes sœurs Saoussan et Imen et mon frère Anis, qu’ils trouvent ici le
témoignage de mon affection.

Au souvenir de mes grand parents, Amna et H’mida.

A ma chère patrie, la Tunisie.




Remerciements



A Monsieur le Dr. Thierry Pillot, qui assure la lourde tâche de guider et veiller
sur l'équipe Neuro. Ses décisions judicieuses quant à l'orientation du projet ont
été indispensables à l'aboutissement de ce travail. Merci pour sa patience et son
soutien indéfectible.


A Madame Le Dr. Brigitte Leineinger-Muller pour avoir assuré mon encadrement
tout au long de ma thèse.


A Madame le Dr. Frances Yen-Potin et Monsieur le Dr. Bernard Bihain de
m'avoir accueilli dans leur laboratoire et de m'avoir donné les moyens de réaliser
cette thèse dans de bonnes conditions.

A l'association Alzheimer 57 nord pour son soutien.

A Monsieur le Pr. François Laurent, Madame le Dr. Bernadette Allinquant et
Monsieur le Dr. Jean-Paul Fuchs d’avoir accepté de juger ce travail.


A Monsieur El Mostapha Zeggari et Madame Hayet Khsiba pour avoir cultivé ma
passion pour la Biologie.


A Monsieur Med Nejib Youssef pour m’avoir apporté son aide et son soutien
tout le long de mon cursus.


A Badreddine Kriem pour m’avoir initié aux techniques des analyses
comportementales. Merci pour ses conseils et son soutien.


A Thierry Oster pour ses conseils et critiques judicieux durant ces trois années
de thèse.

A Violette Koziel pour sa gentillesse, sa disponibilité, son aide précieuse et ses
conseils. Merci pour son soutien aussi bien personnel que professionnel.


A Jean-Luc Olivier pour ses conseils et ses précieuses analyses
bibliographiques.


A Sabrina, Catherine et Lionel pour leurs conseils et leur aide.


A Véronique et Erwan pour m'avoir accueilli dans leur l'animalerie. Merci pour
leur précieuse aide dans la partie in vivo de mon travail.


A tous mes collègues du laboratoire de Médecine et Thérapeutiques Moléculaire.






Ce travail




A été réalisé



Au Laboratoire de Médecine et Thérapeutique Moléculaire



Jeune équipe Lipidomix, JE2482


Institut National Polytechnique de Lorraine


(Pr. F. YEN-POTIN)




15 rue du Bois de la Champelle, 54500 VANDOEUVRE

SOMMAIRE

SOMMAIRE.............................................................................................................................. 3
LISTE DES PUBLICATIONS................................................................................................. 6 S ABREVIATIONS ................................................................................................ 7
LISTE DES FIGURES.............................................................................................................. 8
LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... 10
AVANT-PROPOS ................................................................................................................... 11
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE...................................................................................... 15
1. La maladie d’Alzheimer : Historique................................................................................ 15
2. Généralités ........................................................................................................................... 16
2.1. La maladie d’Alzheimer, un problème de santé publique.................................................. 16
2.2. Prévalence de la maladie d’Alzheimer............................................................................... 17
2.2.1. Répartition en fonction de l’âge 17
2.2.2. Répartition en fonction du sexe....................................................................................... 18
2.2.3. Niveau d’éducation et réseau social 18
2.2.4. Facteurs nutritionnels ...................................................................................................... 20
3. Aspects cliniques de la maladie d’Alzheimer.................................................................... 21
3.1. Circonstances diagnostiques .............................................................................................. 21
3.1.1. Les signes cliniques cognitifs.......................................................................................... 23
3.1.2. Mesure de la sévérité de la démence et critères de diagnostic........................................ 25
3.1.3. L’apport des techniques d’imagerie fonctionnelle.......................................................... 27
3.2. Les traitements actuels de la maladie d'Alzheimer ............................................................ 29
3.2.1. Les inhibiteurs de l’acétylcholinestérase......................................................................... 29
3.2.2. Les agonistes des récepteurs NMDA .............................................................................. 30
3.2.3. Autres médicaments utlisés dans le traitement de la maladie d’Alzheimer.................... 30
4. Caractéristiques histopathologiques de la maladie d’Alzheimer.................................... 31
4.1. Les altérations macroscopiques 31
4.2. Lésions histologiques ......................................................................................................... 32
4.2.1. Les plaques amyloïdes .................................................................................................... 32
4.2.2. Les dégénérescences neurofibrillaires............................................................................. 35
4.2.3. Activation de la microglie et augmentation de la réactivité astrocytaire ........................ 38
4.2.4. L’angiopathie amyloïde cérébrale................................................................................... 40
5. Mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie d’Alzheimer................................ 42
5.1. Introduction ........................................................................................................................ 42
5.2. La perte neuronale, contribution relative des processus apoptotique et nécrotique dans la
maladie d’Alzheimer................................................................................................................. 44
5.3. Un élément clé dans la maladie d’Alzheimer : la protéine APP ........................................ 46
5.3.1. Expression et structure génique de l’APP....................................................................... 46
5.3.2. Structure protéique de l’APP........................................................................................... 47
5.3.3. Fonctions biologiques de l’APP...................................................................................... 49
5.3.4. Clivage protéolytique de l’APP....................................................................................... 50
5.4. Le peptide β-amyloïde agrégé, acteur de la cascade amyloïde .......................................... 55
5.4.1. Structure des fibrilles de peptide A β et formation des plaques....................................... 56
5.4.2. Propriétés neurotrophiques du peptide A β agrégé .......................................................... 58
5.4.3. Cytotoxicité des fibrilles de peptide A β.......................................................................... 59
5.4.4. Mécanismes cytotoxiques liés à l’accumulation de fibrilles de peptide A β ................... 63
5.4.4.1. Le stress oxydant.......................................................................................................... 63
5.4.4.2. Le processus inflammatoire ......................................................................................... 64
5.5 Une alternative à la cascade amyloïde : l’hypothèse A β soluble......................................... 66
35.5.1. Introduction ..................................................................................................................... 66
5.5.2. Forme monomérique et oligomérique du peptide A β ..................................................... 67
5.5.3. Implication dans la perte synaptique et le déclin cognitif............................................... 67
5.5.4. L’interaction avec les membranes cellulaires, première étape de la cascade
neurodégénérative ..................................................................................................................... 69
5.5.4.1. Insertion dans les membranes plasmiques ................................................................... 69
5.5.4.2. Accumulation intraneuronale de peptide A β................................................................ 70
5.5.4.3. Interaction avec un partenaire membranaire neuronal ou glial.................................... 71
5.5.5. Réalité clinique et impact des oligomères solubles de peptide A β dans la MA.............. 72
6. Les modèles in vivo d’étude de la maladie d'Alzheimer .................................................. 75
6.1. Introduction.......... 75
6.2. Les modèles transgéniques de la maladie d’Alzheimer ..................................................... 76
6.2.1. Les souris mono-transgéniques ....................................................................................... 76
6.2.1.1. Les souris transgéniques pour la protéine APP............................................................ 76
6.2.1.2. Les souris transgéniques pour la protéine Tau............................................................. 78
6.2.1.3. Les souris transgéniques pour les présénilines 1 et 2................................................... 79
6.2.1.4. Les souris transgéniques pour l’apolipoprotéine E ...................................................... 79
6.2.1.5. Les souris transgéniques pour la β-secrétase................................................................ 80
6.2.2. Les souris double et triple transgéniques ........................................................................ 81
6.2.2.1. Les modèles transgéniques pour la protéine APP et les PS ........................................ 81
6.2.2.2. Les modèles transgéniques pour la protéine APP et l’apoE......................................... 82
6.2.2.3. Les modèles transgéniques pour la protéine APP et la BACE-1 ................................. 82
6.2.2.4. Les modèles transgéniques pour la protéine APP et Tau............................................. 82
6.2.2.5. Les modèles triple-transgéniques................................................................................. 83
6.3. Les modèles d’injection intracérébrale du peptide A β....................................................... 83
6.3.1. Introduction ..................................................................................................................... 83
6.3.2. Description des études in vivo d’injection de peptide A β ............................................... 88
6.3.2.1. Expériences d’injection de peptides A β agrégés.......................................................... 89
6.3.2.2. Modèles d’injections chroniques de peptides A β......................................................... 94
6.3.2.3. Expériences d’injection de formes non agrégées de peptide A β.................................. 94
6.3.2.4. Les modèles combinant la transgénèse et l'injection.................................................... 97
6.3.3. Approches pharmacologiques de prévention de la toxicité du peptide A β dans les modèles
d’injection intracérébrale........................................................................................................... 97
6.3.3.1. Récepteurs NMDA et récepteurs sigma pour cibles thérapeutiques............................ 98
6.3.3.2. Molécules anti-inflammatoires et antioxydantes.......................................................... 99
6.3.3.3. Molécules antioxydantes............................................................................................ 100
6.3.3.4. Le peptide A β pour cible thérapeutique ..................................................................... 101
6.4. Lésions cérébrales liées au vieillissement chez les primates ........................................... 101
HYPOTHESES DE TRAVAIL ET OBJECTIFS .............................................................. 106
OBJECTIFS........................................................................................................................... 108
PROCEDURES EXPERIMENTALES............................................................................... 110
1. Les animaux....................................................................................................................... 110
2. Préparation des peptides .................................................................................................. 110
3. Modèles cellulaires : cultures primaires de neurones corticaux................................... 111
3.1. Mise en culture des neurones ........................................................................................... 111
3.2. Traitements par le peptide A β soluble.............................................................................. 113
3.3. Traitements par les agents antioxydants........................................................................... 113
3.4. Traitements par les inhibiteurs ......................................................................................... 114
4. Etude de la viabilité cellulaire et des marqueurs d’apoptose........................................ 114
4.1. Test de cytotoxicité .......................................................................................................... 114
44.2. Mesure de la viabilité neuronale par la calcéine .............................................................. 115
4.3. Marquage nucléaire au DAPI : détection des corps apoptotiques.................................... 115
4.4. Mesure de l'activité des caspases ..................................................................................... 116
5. Electrophorèse et immunoblot ......................................................................................... 117
5.1. Electrophorèse.................................................................................................................. 117
5.2. Immunoblot ...................................................................................................................... 118
6. Etude in vivo de la toxicité des peptides A β .................................................................... 120
6.1. Techniques stéréotaxiques d’injection ............................................................................. 120
6.1.1. Anesthésie ..................................................................................................................... 120
6.1.2. Injection intracérébrale.................................................................................................. 120
6.2. Analyses comportementales............................................................................................. 122
6.2.1. Labyrinthe en Y............................................................................................................. 122
6.2.2. Piscine de Morris........................................................................................................... 123
6.2.3. Analyses statistiques des données................................................................................. 127
6.3. Etude du stress oxydant in vivo........................................................................................ 127
6.3.1. Formation des espèces réactives dérivées de l'oxygène (EROs)................................... 127
6.3.2. Mesure de la peroxydation lipidique............................................................................. 128
6.3.3. Mesure de la concentration en protéines....................................................................... 130
7. Techniques d'histochimie et immunohistochimie........................................................... 131
7.1. Fixation du cerveau par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde ......................... 131
7.2. Coupes des cerveaux au cryostat...................................................................................... 132
7.3. Marquages immunohistologiques .................................................................................... 133
7.4. Coloration histologique à l’acétate de thionine................................................................ 135
RESULTATS - PREMIERE PARTIE .............................................................................. 137
1. Etude des propriétés neurotoxiques des peptides A β tronqués dans leur domaine amino-
terminal. ................................................................................................................................. 138
1.1. Introduction ...................................................................................................................... 138
1.2. Objectifs ........................................................................................................................... 139
1.3. Résultats - MANUSCRIT # 1 ........................................................................................ 140
1.4. Discussion ........................................................................................................................ 174
RESULTATS - DEUXIEME PARTIE 179
2. L’humanine, un peptide neuroprotecteur : étude de ses effets in vivo et in vitro........ 180
2.1. Introduction........ 180
2.2. Objectifs.......... 186
2.3. Résultats - MANUSCRIT # 2 ....................................................................................... 188
2.4. Discussion........ 229
CONCLUSION GENERALE .............................................................................................. 236
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................ 240
ANNEXES.............................................................................................................................. 267
PUBLICATION # 1............................................................................................................... 268 CATION # 2 281







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