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UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE
FACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE
THESE
présentée et publiquement soutenue
pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE
par Lucile RYCKEBÜSCH
spécialité : Biologie du développement

Sujet : ETUDE DU RÔLE DE LA SIGNALISATION RETINOÏDE LORS
DE LA CARDIOGENESE CHEZ LA SOURIS


Soutenue le 5 juillet 2010, devant la Commission d’examen
Mme la Pr Margaret BUCKINGHAM, rapporteur
M le Dr Pascal DOLLE, rapporteur
Mme la Pr Nicole PHILIP, examinateur
M le Dr Mathias MERICSKAY, examinateur
Mme la Pr Christine VOLA, examinateur
M le Dr Stéphane ZAFFRAN, directeur de thèse
UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE
FACULTE DE MEDECINE DE MARSEILLE
THESE
présentée et publiquement soutenue
pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE
par Lucile RYCKEBÜSCH
spécialité : Biologie du développement

Sujet : ETUDE DU RÔLE DE LA SIGNALISATION RETINOÏDE LORS
DE LA CARDIOGENESE CHEZ LA SOURIS


Soutenue le 5 juillet 2010, devant la Commission d’examen
Mme la Pr Margaret BUCKINGHAM, rapporteur
M le Dr Pascal DOLLE, rapporteur
Mme la Pr Nicole PHILIP, examinateur
M le Dr Mathias MERICSKAY, examinateur
Mme la Pr Christine VOLA, examinateur
M le Dr Stéphane ZAFFRAN, directeur de thèse
1








Ce proverbe affiché sur la porte de mon laboratoire lors de mon master 2 et de mes
deux premières années de thèse m’a souvent « donné du cœur à l’ouvrage » et « mis du
baume au cœur » :











« Ce n'est qu'en essayant continuellement que l'on finit par réussir. Autrement dit : plus
ça rate, plus on a de chances que ça marche. »
Proverbe Shadok










2

Je remercie le Professeur Margaret Buckingham et le Dr Pascal Dollé d’avoir accepté d’être
rapporteurs de ce travail. Je remercie le Dr Mathias Mericskay, le Pr Nicole Philip et le Pr
Christine Vola d’avoir accepté de juger ma thèse.

Ces travaux ont pu être réalisés grâce au soutien du Ministère de l’Education Nationale, de
l’Association Française de lutte contre les Myopathies et de l’Agence Nationale pour la
recherche (maladies rares). Je remercie la Société Française de Biologie du Développement de
m’avoir octroyé une bourse de voyage.

Je remercie le Dr Robert Kelly pour les discussions scientifiques que nous avons eues et l’aide
précieuse apportée pour l’observation et la caractérisation des anomalies cardiaques. Je
remercie son équipe et en particulier Francesca Rochais pour son aide technique des mesures
de la voie efférente et pour sa gentillesse, Magali Théveniau-Ruissy pour son aide dans les
dissections de cœurs fœtaux et pour l’acquisition des photos, pour le partage de son expertise
des coronaires, Karim Mesbah pour sa grande disponibilité et son aide technique précieuse.

Je remercie Fanny Bajolle pour sa sympathie et son aide dans la caractérisation des
malformations cardiaques fœtales et la ballade en cable cars décoiffante !
Je remercie particulièrement Karen Niederreither pour son accueil au Baylor College of
Medicine de Houston, pour notre collaboration sur les cultures de proépicarde. Ce fut une
expérience enrichissante.

Je remercie l’équipe du Dr Michel Sémériva et en particulier Sébastien Sénatore, Ramy
Reddy Vatrapu, Jesus deCelis, Martine Astier, Laurence Röder, Delphine Potier et Pierre-
Adrien Salmand pour leur aide et les discussions sympathiques que nous avons échangées.

Je remercie Delphine Coiffier de m’avoir encadré durant mon Master 2, de m’avoir appris la
rigueur, l’organisation et l’efficacité dans le travail au laboratoire.

Je remercie Nicolas El Robrini pour sa bonne humeur et son aide technique sur l’étude des
coronaires.

Je remercie les personnes de l’U910 du Professeur N. Levy pour leur gentillesse et leur
attention.

Je remercie Christophe pour sa disponibilité et pour s’être occupé si bien de nos souris.

Je remercie très chaleureusement Nicolas Bertrand pour sa bienveillance et ses
encouragements, son aide, le partage de ses connaissances et son aide technique. Il a été
pendant mes études un excellent professeur et durant ma thèse un excellent coéquipier.

Ma plus grande gratitude revient à Stéphane Zaffran pour la confiance qu’il m’a accordée. Je
le remercie de m’avoir guidé durant ces quatre années, de m’avoir aidé et de m’avoir confié
des projets si intéressants. Il m’a transmis le « goût » de la recherche. Les discussions
3

scientifiques que nous avons eues m’ont formé et m’ont permis d’acquérir de bonnes bases
scientifiques. Je le remercie pour son enthousiasme, ses encouragements et sa grande
disponibilité. Je le remercie également pour le relecture et la correction de ce manuscrit.
Je me suis épanouie auprès de ces deux talentueux chercheurs.

Je remercie les amis que j’ai pu rencontrés au cours de ma thèse. Le kayak et le Corbusier
avec Fred, toutes les discussions interminables que nous avons eues ! Fanny, ma copine de la
montagne, pour être si drôle et surtout pour Ocean Boulevard et nos faux ongles américains
« promis, si on se dispute, on reste ensemble ! » et nos sorties au ski, PA-caliméro et nos
pauses café si sympathiques, Elise, son dynamisme et sa bonne humeur, Cécile pour ses bons
conseils et sa bonne humeur communicative, Sébastien, le génial Mc Gyver du labo : nous
avons usé les bancs de la fac ensemble dans une bonne ambiance, excellent danseur à ses
heures et pour s’être occupé de mes coupures au cryostat, Ahmed pour sa gentillesse et son
grand cœur, Isma, Emilie, Reina, Manue, Sophie et Nicolas. Aux sorties filles et à Céline !

Je remercie le club de pirogue polynésienne, ManuUra 13, ma bulle d’air du week-end. Les
magnifiques sorties en mer, le goût de l’effort et l’esprit de famille : le Tahoé.

Je remercie mes sympathiques collocs : Emilie et nos excellentes soirées partagées, les virées
au parc Borély, merci de m’avoir châlé sur ton vélo et merci pour tes danses grunges, tes
délicieux cocktails et tes pâtes thon-pesto et Steven-the-place-to-be.

Je remercie enfin les gens qui mettent des p’tites lumières dans ma vie qui me soutiennent et
que j’aime :

Je remercie mes amis, votre amitié est un trésor : Pierre et ses pieds légendaires, Cédric et son
appétit mythique et Thibaut et son grand-n’importe-quoi-mais-immensément-généreux
fantastique (et ses chaussettes de ski et ses sandwichs BN-saucisson…).

Je remercie très chaleureusement Audrey, mon amie, pour tous les moments épicuriens que
nous avons passés ensemble. Je la remercie d’être toujours aussi présente depuis plus de 13
ans, à mon écoute. Les moments que nous partageons ensemble sont uniques !

Je remercie mes fantastiques parents qui m’ont soutenu dans mes choix. Ma mère, mon
modèle et mon père, mon héros. Je suis fière d’être votre fille.

Je remercie Romuald, mon amour, pour les sorties sportives et les ballades, l’inoubliable via-
ferrata corse, le voyage à SF, notre complicité, son attention, son soutien et le courage qu’il
me donne et pour tous les bons moments que nous passons ensemble.

Enfin, je remercie Mimine, mon super chat, pour l’attention particulière qu’elle a eu au cours
de l’écriture de ce manuscrit à dormir lovée sur mon bras.

Je dédie cette thèse à ma grand-mère Mauricette, j’espère avoir un jour son courage.
4

RESUME

L’acide rétinoïque (AR), dérivé actif de la vitamine A, agit comme un morphogène
dans de nombreux processus de développement. Des études antérieures chez l’embryon de
poulet (Hochgreb et al., 2003) ont montré que l’AR est impliqué dans la régionalisation
antéro-postérieure du tube cardiaque. Au cours de ma thèse, j’ai cherché à définir le rôle de
l’AR dans le développement du cœur et plus particulièrement dans la régionalisation antéro-
postérieure du territoire cardiaque. Pour cela, j’ai utilisé les mutants souris déficients pour
l’enzyme RALDH2 permettant la synthèse d’AR. L’utilisation de marqueurs spécifiques des
progéniteurs cardiaques nous a permis de montrer que l’AR est requis pour établir la bordure
postérieure du second champ cardiaque (mésoderme splanchnique).
Dans le but de mieux comprendre comment la voie de l’AR agit sur la spécification
cardiaque, nous avons voulu identifier ses cibles dans le mésoderme splanchnique. Pour la
première fois, nous montrons l’implication des gènes Hox dans la cardiogenèse précoce.
L’analyse du lignage des cellules exprimant Hoxa1, Hoxa3 et Hoxb1 nous a permis de
montrer que les pôles artériels et veineux ont la même origine au niveau du territoire
cardiaque.
Nous avons aussi étudié le rôle de l’AR dans la morphogenèse des arcs aortiques et de ses
dérivés, en particulier son influence sur le développement de la quatrième artère des arcs
pharyngés. Cette étude a mis en évidence l’interaction génétique de Raldh2 et du facteur à
boîte T, Tbx1, lors de la morphogenèse du quatrième arc aortique. En effet, la diminution de
l’AR accélère la récupération des défauts de la quatrième artère des arcs pharyngés chez le
+/-modèle murin pour le syndrome de DiGeorge (Tbx1 ). Nos résultats suggèrent que l’AR est
un modificateur de la micro-délétion 22q11 (syndrome de DiGeorge) chez l’homme, ceci
pouvant expliquer en partie la grande variabilité des malformations cardiaques des patients
DiGeorge.
J’ai aussi participé à l’étude du rôle de l’AR dans la différenciation des progéniteurs du
myocarde ventriculaire. Ces résultats montrent que l’AR est nécessaire à la différenciation de
la population de cellules progénitrices du myocarde. La portée de ces résultats est importante
et pourra conduire à plus long terme à la thérapie et la réparation du muscle cardiaque. Enfin,
la dernière partie de l’étude se concentre sur le rôle de l’AR dans le développement de la
vasculature coronaire. Ce morphogène semble influencer le positionnement des ostia
coronaires à l’aorte.

5

SUMMARY

Retinoic acid (RA), the active derivative of vitamin A (retinol), acts as a morphogen in
several developmental processes. Previous studies in the chick embryo (Hochgreb et al.,
2003) have indicated that RA signaling is required to antero-posterior patterning of the
cardiac tube. The aim of my thesis was to define the role of RA signaling in heart
development and in particular in the establishment of antero-posterior identity of the cardiac
field. Thus, we used Raldh2 (Retinaldehyde dehydrogenase 2) mutants that are deficient for
RA synthesis. To understand the role of RA, we examined the contribution of the second heart
-/-
field to pharyngeal mesoderm, atria and outflow tract in Raldh2 embryos. Our findings
shown that embryo lacking RA synthesis enzyme RALDH2 have expansion of the second
heart field (splanchnic mesoderm).
To better understand the mechanism by which RA signaling regulates the cardiac progenitors,
we have identified its targets in the splanchnic mesoderm. We have shown for the first time
that Hox genes contribute to cardiogenesis. Moreover, genetically labeled cells analysis
reveals a common origin of the arterial and venous poles in the cardiac field.
Then, we have analyzed the role of RA in aortic arch remodeling, in particular its influence on
fourth aortic arch arteries. This work demonstrates a genetic interaction between Raldh2 and
the T-box factor, Tbx1, during fourth aortic arch formation. Our results shows that decreased
-/-
on RA level accelerates recovery of fourth aortic arch artery defects seen in Tbx1 , which is a
model of DiGeorge syndrome. Moreover, this study suggests that RA is a modifier of 22q11
microdeletion (DiGeorge syndrome) in patient.
In a collaborative work, we have analyzed the role of RA in differentiation of ventricular
myocardium progenitors. Our results showed that the differentiation of the myocardial
progenitor cells required RA. The impact of these results is crucial and would lead to therapy
and cardiac muscle repair.
The last part of my thesis focuses on the role of RA on coronary vascular development. This
morphogen seems to influence the position of coronary ostia to the aorta.





6

TABLE DES MATIERES

RESUME………………………………………………………………………………………5
SUMMARY……………………………………………………………………………………6
TABLE DES ILLUSTRATIONS…………………………………………………………… 11
ABREVIATIONS………………………………………….14

I. INTRODUCTION 17

1. Stades précoces du développement cardiaque 19
1.1 L’induction, la spécification et la détermination du lignage cardiaque 19
1.2 Morphogenèse du cœur primitif 20
1.3 Le second champ cardiaque 21

2. Stades embryonnaires et fœtaux du développement cardiaque
2.1 La prolifération myocardique 24
2.2 Le développement des chambres : myocarde primaire et fonctionnel 26
2.3 Le développement des trabécules du myocarde et la compaction 27
2.4 Le développement des pôles artériels et veineux du cœur 29
2.4.1 Le développement du pôle artériel 29
2.4.2 Le développement du pôle veineux 30
2.5 Le développement de la vasculature coronaire 31
2.6 L’appareil pharyngé et le remodelage des artères des arcs pharyngés 32

3. Les cellules extra-cardiaques et leurs contributions à la formation du cœur 35
3.1 Les cellules de la crête neurale cardiaques 35
3.2 Les cellules dérivées du proépicarde 36

4. La voie de signalisation de l’acide rétinoïque 38
4.1 La synthèse, la dégradation et la signalisation de l’acide rétinoïque 38
4.2 L’implication de l’acide rétinoïque au cours du développement du système
cardiovasculaire 42
7

4.3 Les effets de l’acide rétinoïque sur le développement de la région
oropharyngée 44
4.4 Les gènes cibles de l’acide rétinoïque : les gènes Hox 47


5. Le syndrome de Di-George ou syndrome Vélo-Cardio-Facial 49


6. Les malformations cardiaques congénitales : cas des anomalies
conotroncales 53


II. MATERIELS ET METHODES

1. Accouplements 55
2. PCR (réaction de polymérisation en chaîne) 55
3. Electrophorèse en gel d’agarose 57
4. Transformation de bactéries thermocompétentes 57
5. Minipréparation d’ADN plasmidique 57
6. Digestion enzymatique 58
7. Maxipréparation d’ADN plasmidique 58
8. Hybridation in situ sur embryon entier 59
8.1 Préparation de l’ADN matriciel 59
8.2 Synthèse de sonde ARN anti-sens 59
8.3 Prélèvement et dissection d’embryons 60
8.4 Hybridation in situ 60
9. Coloration X-gal 62
10. Cryosections d’embryons 62
11. Coloration éosine de sections 63
12. Hybridation in situ sur sections d’embryons 63
13. Immunohistochimie sur sections d’embryons de souris 64
14. Traitements à l’acide rétinoïque 64
14.1 Sauvetage de la mutation Raldh2 64
14.2 Traitement à l’acide rétinoïque 64
8

15. Culture d’explants embryonnaires 65
16. Culture d’explants de coussins endocardiques ou de proépicarde 65
17. Injection d’encre intraventriculaire 66
18. Observations et acquisitions 66


III.OBJECTIFS DE LA THESE 67


IV. RESULTATS

Article 1 : Retinoic acid deficiency alters second heart field formation 69

Article 2 : The Hox fate map reveals common origin of both the venous
and arterial poles of the forming heart tube 84

Article 3 : Endogenous retinoic acid regulates cardiac progenitor
differentiation 114

Article 4 : Exploration du patron des artères coronaires dans des modèles
murins d’anomalies conotroncales : en absence et en excès d’acide
rétinoïque 124
4.1 Le développement de la vasculature coronaire en excès d’acide
rétinoïque 125
4.2 Le développement de la vasculature coronaire en absence d’acide
rétinoïque 126

Article 5 : Decreased levels of embryonic retinoic acid synthesis accelerate
recovery from arterial growth delay in a mouse model of DiGeorge
syndrome 130




9