Etude par microscopie électronique des mécanismes d'action de vecteurs synthétiques pour le transfert de gènes

Olivier Le Bihan

Description

Sous la direction de Olivier Lambert
Thèse soutenue le 16 décembre 2009: Bordeaux 1
La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe2O3) dense aux électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre son mécanisme d’action.
-Microscopie électronique
-Cryo-microscopie électronique
-Nanoparticules
-Vecteurs synthétiques
-Transfert de gènes
-Lipides cationiques
-Tomographie
-Copolymères à blocs
The vast majority of clinical trials of gene transfer in vivo use viral vectors. Although they are effective, they induce immunogenic, toxic or mutagenic risks. Due to their high modularity and low toxicity, synthetic vectors (non viral), represent a promising alternative despite their lack of effectiveness. The major objective of this work was to understand the mechanism of gene transfer using two prototypic synthetic vectors, in the context of a rational design of new vectors. We studied on cultured cells, the mechanism of action of two cationic lipids; BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) and DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) formulated with plasmid DNA (lipoplexes) which are in vitro efficient vectors. We have been able to visualize by electron microscopy, their intracellular pathways, their structural alterations and their endosomal escape, the latter being a key step in the process of gene transfer. The unambiguous identification of lipoplexes throughout their intracellular trafficking has been made possible thanks to the labelling of DNA by core-shell silica nanoparticles with an electron dense maghemite core (Fe2O3). The labeling strategy has also been applied to study the mechanism of action of a nonionic block copolymer (P188 or Lutrol). Interestingly, these synthetic vectors have an in vivo transfection efficiency in mice lung and muscle tissue while they are totally inefficient in vitro. We have shown that Lutrol induces an increase of DNA internalization into cells and fails to trigger endosomal escape, which would explain the lack of in vitro efficacy. These findings suggest that the in vivo mechanism of action of Lutrol would involve other internalization pathways.
-Electron microscopy
-Cryo-electron microscopy
-Nanoparticles
-Synthetic vectors
-Gene transfer
-Cationic lipids
-Tomography
-Block copolymers
Source: http://www.theses.fr/2009BOR13972/document

Sujets

• Microscope électronique
• Nanoparticule
• Tomographie

Informations

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Extrait

N° d’ordre : 3972



THESE

PRESENTEE A

L’UNIVERSITE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE


Par Olivier LE BIHAN


POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR
SPECIALITE : BIOCHIMIE



Etude par microscopie électronique des mécanismes d'action
de vecteurs synthétiques pour le transfert de gènes


Thèse dirigée par Olivier LAMBERT

Soutenue le 16 décembre 2009



Devant la commission d’examen formée de :


M. Patrick MIDOUX, Directeur de recherche INSERM Rapporteur
M. Patrick SCHULTZ, Directeur de recherche CNRS Rapporteur
M. Philippe BARTHELEMY, Professeur Université Bordeaux 2 Examinateur
M. Gilles CHARPENTIER, Professeur Université Bordeaux 1 Examinateur
M. Bruno PITARD, Directeur de recherche CNRS Examinateur
M. Olivier LAMBERT, Directeur de recherche CNRS Directeur de thèse

Résumé
La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs
viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire
mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur
faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur
utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de
comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs
synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de
nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de
gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la
DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs
efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies
d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui
représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des
lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage
de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe O ) dense aux 2 3
électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme
d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique
P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une
efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou
en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous
avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les
cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence
d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre
son mécanisme d’action.

Abstract
The vast majority of clinical trials of gene transfer in vivo use viral vectors. Although they are
effective, they induce immunogenic, toxic or mutagenic risks. Due to their high modularity
and low toxicity, synthetic vectors (non viral), represent a promising alternative despite their
lack of effectiveness. The major objective of this work was to understand the mechanism of
gene transfer using two prototypic synthetic vectors, in the context of a rational design of new
vectors. We studied on cultured cells, the mechanism of action of two cationic lipids; BGTC
(bis(guanidinium)-tren-cholesterol) and DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine)
formulated with plasmid DNA (lipoplexes) which are in vitro efficient vectors. We have been
able to visualize by electron microscopy, their intracellular pathways, their structural
alterations and their endosomal escape, the latter being a key step in the process of gene
transfer. The unambiguous identification of lipoplexes throughout their intracellular
trafficking has been made possible thanks to the labelling of DNA by core-shell silica
nanoparticles with an electron dense maghemite core (Fe2O3). The labeling strategy has also
been applied to study the mechanism of action of a nonionic block copolymer (P188 or
Lutrol). Interestingly, these synthetic vectors have an in vivo transfection efficiency in mice
lung and muscle tissue while they are totally inefficient in vitro. We have shown that Lutrol
induces an increase of DNA internalization into cells and fails to trigger endosomal escape,
which would explain the lack of in vitro efficacy. These findings suggest that the in vivo
mechanism of action of Lutrol would involve other internalization pathways. Remerciements

Ce travail a été réalisé au sein de l’équipe d’Architecture des Complexes
Membranaires et Processus Cellulaires du laboratoire de Chimie et Biologie des Membranes
et Nano-objets (CBMN), sous la direction du docteur Olivier LAMBERT à qui j’exprime ma
plus profonde gratitude pour m’avoir choisi pour mener à bien cette thèse alors que je n’avais
aucune expérience de la microscopie électronique. Merci de m’avoir fait découvrir cet univers
passionnant dans lequel j’espère pouvoir continuer à évoluer dans les années futures.
J’adresse mes plus sincères remerciements aux membres du jury pour avoir accepté
d’évaluer ma thèse ; messieurs Patrick MIDOUX et Patrick SCHULTZ rapporteurs de ma
thèse et messieurs Bruno PITARD, Philippe BARTHELEMY et Gilles CHARPENTIER
examinateurs de ma thèse.
Je remercie le Professeur Alain BRISSON, directeur de l’unité d’Imagerie Moléculaire
et NanoBioTechnologie au sein duquel j’ai débuté ma thèse. Je remercie également Erick
DUFOURC, directeur du laboratoire CBMN.
Je remercie tout particulièrement les membres actuels ou antérieurs de notre équipe
qui de part la diversité de leurs compétences m’ont été d’une aide précieuse durant toute ma
thèse. Merci à Sylvain TREPOUT qui m’a formé à la Cryo-Microscopie Electronique, dans la
bonne humeur et avec tout le dynamisme qui le caractérise. Merci à Pierre BONNAFOUS
pour son implication à des degrés divers dans ce travail. Je remercie également le professeur
Jean-Christophe TAVEAU pour ses compétences en analyse d’image qui m’ont été d’une très
grande aide lors de la reconstruction des volumes tomographiques et de leurs post-traitements.
Je n’oublie pas les stagiaires et les non-permanents qui ont participé à ce travail ; Sarah
AVENTIN, Anaïs CARPENTIER et Ptissam BERGAM.
Je tiens également à remercier les autres membres du laboratoire CBMN qui m’ont
permis de travailler dans un excellent climat. Merci à Céline GOUNOU, Joséphine LAI KEE
HIM, Boris GARNIER pour les résultats préliminaires qu’il a obtenu durant son stage de
Master 2 et qui ont servis de base à mon travail, Sisareuth TAN qui m’a initié aux techniques
d’inclusion et d’ultramicrotomie. Merci à Anthony BOUTER qui m’a été d’une grande aide
en culture cellulaire et en microscopie de fluorescence. Un grand merci à Nicolas ARRAUD, Rémi BERAT et Benoit FAURIE pour les discussions scientifiques ou non, toujours très
enrichissantes.
J’adresse également mes remerciements aux collaborateurs qui ont participé
activement au bon déroulement de ce projet. Je remercie en particulier Bruno PITARD et les
membres de son équipe « Nanovecteurs pour le transport de macromolécules biologiques » de
l’institut du thorax à Nantes qui nous a fourni les plasmides, vecteurs synthétiques et avec qui
nous avons établi une collaboration étroite sur cette thématique de l’étude des mécanismes de
transfert de gènes par les vecteurs synthétiques. Je remercie particulièrement Raphaël
CHEVRE avec qui j’ai beaucoup interagit de part la proximité de nos sujets de thèse
respectifs. Un grand merci à Etienne GONTIER, responsable de la plateforme de microscopie
électronique BIC (Bordeaux Imaging Center) à l’université Bordeaux 2, et à son expérience
des cryométhodes qui nous a permis de réaliser la congélation haute pression des échantillons
cellulaires ainsi que leur cryosubstitution. Je souhaiterais également remercier Stéphane
MORNET, chercheur à l’Institut de Chimie et Matière Condensée de Bordeaux (ICMCB) qui
a synthétisé les nanoparticules de silice nues ou modifiées en surface que j’ai utilisé durant
cette thèse.