Exploring the function of IL-10, BTLA and DCs as regulators of immune responses [Elektronische Ressource] / Nir Yogev

Sonja Reissig

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• Publié par: johannes_gutenberg-universitat_mainz
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 21
• Langue: English
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Extrait

 
 
 
 
Exploring  the  function  of  IL -­10,  BTLA  and  
DCs  as  regulators  of  immune  responses  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertation  
Zur  Erlangung  des  Grades  
Doktor  der  Naturwissenschaf  t
 
 
 
 Am  Fachbereich  Biolog  ie
der  Johannes  Gutenberg -­‐Universität  Mainz  
 
   
Nir  Yogev  
 
geb.  am  31.  Dezember  1973  in  Kibutz  Kineret,  Isr  ael
 
 
Mainz,  2010  ABBREVIATIONS................................ ................................ ................................ ................................ ..IV  
1   INTRODUCTION ............................... 1  
1.1   INTERLEUKIN -­‐10 ........... 4  
1.1.  1 IL-­10  protein,  gene  and  expression4  
1.1.  2 IL-­10  receptor  and  signaling ...........................................................................5  
1.1.  3 IL-­10R  signal  transduction...............6  
1.1.  4 IL-­10  Function........6  
1.1.4.1   Antigen  presenting  cells ............ 6  
1.1.4.2   T  cell................................s ................. 7  
1.1.  5 IL-­10  in  infectious  disease8  
1.1.  6 IL-­10  in  autoimmunity.......................9  
1.1.  7 IL-­10  and  experimental  autoimmune  encephalomyelitis.................10  
1.2   B  AND  T  L YMPHOCYTE   ATTENUATOR ................................ ................................ ................................ ....11  
1.2.  1 Co -­receptors  of  the  CD28  and  TNFR  superfamilies.............................12  
1.2.  2 BTLA  structure,  expression  and  signaling...............13  
1.3   DENDRITIC  CELLS ................................ ........15  
2   MATERIALS  AND  METHOD S................................ ................................ ................................ .....17  
2.1   CHEMICALS  AND  BIOLOGI CAL  MATERIAL 17  
2.2   M OLECULAR  BIOLOGY 19  
2.2.  1 Competent  cels  and  isolation  of  plasmid  DNA......19  
2.2.  2 Isolation  of  genomic  DNA  from  ES  cells  and  mouse  organs.............19  
2.2.  3 RT -­PCR  and  quantitative  real -­time  PCR ...................................................20  
2.2.  4 Agarose  gel  electrophoresis  and  DNA  gel  extraction.........................20  
2.2.  5 DNA  sequencing ..................................................................20  
2.2.  6 Quantification  of  DNA......................21  
2.2.  7 Polymerase  Chain  Reaction  (PCR)..............................21  
2.2.  8 Southern  blot  analysis22  
2.3   CELL  BIOLOGY .............. 23  
2.3.  1 Embryonic  stem  cel  culture ..........................................23  
2.3.  2 Tat -­Cre  protein  (HTNC)  treatment.............................................................24  
2.3.  3 EL-­4  cell  line  culture  and  electroporation...............24  
2.3.  4 Preparation  of  Mouse  Embryonic  Fibroblasts  (MEFs).......................25  
2.3.  5 Preparation  of  c ells  from  lymphoid  organs............25  
2.3.  6 Culture  of   ex  vivo  lymphocytes.....26  
2.3.  7 Cel  counting .........................................26  
2.3.  8 Adoptive  T  cel  transfer  and  CFSE  labeling.............26  
2.3.  9 Flow  Cytometry...................................27  
2.3.10   Flow  Cytometry  and  Intracelular  Cytokine  Staining  (ICS)...........28  
2.3.11   Magnetic  cel  sorting  and  FACS  sorting.................29  
2.3.12   Isolation  of  CNS  infiltrates29  
2.3.13   Isolation  of  splenic  DCs..................30  
2.3.14   Induction  of  CD11c -­CreER  activity   in  vivo..........................................30  T
2.3.15   In  vitro  2D2 -­iTreg  differentiation  and  analysis..30  
2.3.16   T  and  iTreg  in  vitro  Differentiation ......................................................30  eff
2.4   IN  VIV  DOEPLETION  OF  CD25+  CELLS .....31  
2.5   IN  VIV  DOEPLETION  OF  DENDRITIC  CELLS .............................. 31  
2.6   TISSUE  PREPARATION  FOR  IMMUNOH ISTOCHEMISTRY ........32  
2.6.  1 Flow -­Cytomix ........................................32  
2.6.  2 ELISA........................32  
II  2.7   M OUSE  E XPERIMENTS ................................ ................................ ................................ ............................... 32  
2.7.  1 Induction  and  assessment  of  EAE................................32  
2.7.  2 Induction  and  assessment  of  Colitis............................33  
2.7.  3 MCMV  and  MHV  Infection ...............................................33  
2.8   STATISTICS ................... 34  
2.9   M ICE ................................ .............................. 34  
3   RESULTS .......... 35  
3.1   INTERLEUKIN -­‐10 ................................ ........35  
3.2   BTLA ............................ 57  
3.2.  1 Generation  of  BTLA  over  expressing  mouse............................................57  
3.2.  2 BTLA  over  expression  by  dendritic  cels...................62  
3.2.  3 BTLA  over  expression  by  T  cels ...................................70  
3.3   DENDRITIC  CELLS ........82  
4   DISCUSSIO................................N ...99  
4.1   INTERLEUKIN -­‐10 ........99  
4.2   B  AND  T  L YMPHOCYTE   ATTENUATOR ................................ .101  
4.3   DENDRITIC  CELLS ................................ .....105  
5   REFERENCES ................................ ................................ 109  
6   SUMMARY ................................ .....130  
7   ZUSAMMENFASSUNG ................ 131  
8   ACKNOWLEDGEMENTS ................................ ................................ ............ 132  
9   LEBENSLAUF 133  
10   PUBLICATIONS ................................ ......................... 134  
11   ERKL ÄRUNG ................................ ................................ .............................. 135  
 
 
 
 
 
 
 
III  Abbreviations    
 
Ab       antibody    
ALT              al  a  ni  ne  transaminase  
APC     antigen  presenting  cell  or  allophycocyanin    
approx.     approximately    
BAC     bacterial  artificial  chromosome  
Bio     biotinylated    
β-­‐ME     β-­‐mercaptoethanol    
bp       base  pair    
BMDCs          bone  marrow  derived  dendritic  cells    
BSA       bovine  serum  albumin    
°C       temperature  in  celsius  degrees    
CD       cluster  of  differentiation    
CFA       Complete  Freund’s  Adjuvant    
CFSE              c  arboxyfluorescein  diacetate  succinimidyl  ester  
cDNA     complementary  DNA    
CNS       central  nervous  system    
cpm       counts  per