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Expression and characterization of P-type ATPases for structural studies [Elektronische Ressource] / von Sivaram Chandra Chintalapati

174 pages
Expression and Characterization ofP-type ATPases for Structural StudiesDissertationZur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaftenvorgelegt beim Fachbereich Biochemie, Chemie und PharmaziederJohann Wolfgang Goethe Universität in Frankfurt am MainvonSivaram Chandra Chintalapatiaus Tenali, IndienFrankfurt am Main 2007Die Arbeit wurde in der Abteilung Structural Biology des Max-Planck-Instituts fürBiophysik in Frankfurt am Main durchgeführt und vom Fachbereich Biochemie,Chemie und Pharmazie der JohannWolfgang Goethe Universität als DissertationangenommenDekan:1. Gutachter: Prof. Dr. Bernd Ludwig2. Gutachter: Prof. Dr. Werner KuehlbrandtDatum der Disputation:Diese Doktorarbeit wurde vom 28. Januar 2003 bis zum 15 Januar 2007 unter Leitung vonProf. Dr. Werner Kühlbrandt im Abteilung für Strukturbiologie am Max planck Institut fürBiophysik in Frankfurt am Main durchgeführt.Eidesstattliche ErklärungHiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt habeund keine weiteren Hilfsmitten und Quellen als die hier aufgeführten verwendet habe.Sivaram Chandra ChintalapatiFrankfurt am Main, den 15 Januar 2007. TABLE OF CONTENTSSUMMARY i-iiiCHAPTER 1 INTRODUCTION 11.1 Proteins in biological membranes 11.2 Transport of solutes across the cell membrane 21.3 Ion transporting proteins 21.4 Ion pumps and ATP hydrolysis 31.5 P-type ATPases 41.5.1 Introduction 41.5.2 Types of P-type ATPases 51.5.
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Expression and Characterization of
P-type ATPases for Structural Studies
Dissertation
Zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften
vorgelegt beim Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazieder
Johann Wolfgang Goethe Universität in Frankfurt am Main
von
Sivaram Chandra Chintalapati
aus Tenali, Indien
Frankfurt am Main 2007Die Arbeit wurde in der Abteilung Structural Biology des Max-Planck-Instituts für
Biophysik in Frankfurt am Main durchgeführt und vom Fachbereich Biochemie,
Chemie und Pharmazie der JohannWolfgang Goethe Universität als Dissertation
angenommen
Dekan:
1. Gutachter: Prof. Dr. Bernd Ludwig
2. Gutachter: Prof. Dr. Werner Kuehlbrandt
Datum der Disputation:Diese Doktorarbeit wurde vom 28. Januar 2003 bis zum 15 Januar 2007 unter Leitung von
Prof. Dr. Werner Kühlbrandt im Abteilung für Strukturbiologie am Max planck Institut für
Biophysik in Frankfurt am Main durchgeführt.
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt habe
und keine weiteren Hilfsmitten und Quellen als die hier aufgeführten verwendet habe.
Sivaram Chandra Chintalapati
Frankfurt am Main, den 15 Januar 2007. TABLE OF CONTENTS
SUMMARY i-iii
CHAPTER 1 INTRODUCTION 1
1.1 Proteins in biological membranes 1
1.2 Transport of solutes across the cell membrane 2
1.3 Ion transporting proteins 2
1.4 Ion pumps and ATP hydrolysis 3
1.5 P-type ATPases 4
1.5.1 Introduction 4
1.5.2 Types of P-type ATPases 5
1.5.3 Structural studies of P-type ATPases 7
2+1.5.3.1 Ca ATPase 8
+ +1.5.3.2 Na , K ATPase 10
1.5.3.3 Proton pump from Neurospora crassa 10
1.5.3.4 The need to study more P-type ATPases 10
1.6 The focus of current study 12
1.7 Plant plasma membrane proton transporting ATPase 12
1.8 Heavy metal transporting ATPases 13
1.9 Characteristic features of P -ATPases 13IB
1.10 Copper transport by P -ATPases 15IB
1.10.1 CopA 15
1.10.2 CopB 17___________________________________________________TABLE OF CONTENTS
1.11 Copper homeostasis in cells 18
1.12 Clinical importance of copper transporters 19
1.13 Membrane proteins for structural studies 20
1.13.1 E. coli expression system 20
1.13.2 Saccharomyces cerevisiae 22
1.13.3 Pichia pastoris 23
1.13.4 Other eukaryotic expression systems 24
1.13.5 Cell-free expression systems 25
1.14 Methods to study membrane proteins 25
1.14.1 3D crystallization and X-ray crystallography 27
1.14.2 Electron microscopy 28
1.15 Aim of current study 31
1.15.1 Plant proton ATPase 31
1.15.2 A. aeolicus copper ATPases 31
CHAPTER 2 MATERIALS AND METHODS 33
2.1 Materials 33
2.2 Basic molecular biology techniques 33
2.2.1 Strains of yeast used 33
2.2.2 Strains of bacteria used 34
2.3 PCR amplification and cloning 34
2.4 Transformation 34
2.4.1 Saccharmyces cerevisiae 34
2.4.2 Pichia pastoris 35___________________________________________________TABLE OF CONTENTS
2.4.3 E. coli 36
2.4.3.1 Chemical transformation 36
2.4.3.1.1 Preparation of competent cells 36
2.4.3.1.2 Method 36
2.4.3.2 Electroporation 36
2.5 Maintenance of stocks 37
2.5.1 Yeast strains 37
2.5.1.1 Glycerol stocks 37
2.5.1.2 Agar plates 37
2.5.1.2.1 P. pastoris strains 37
2.5.1.2.2 Saccharomyces cerevisiae 38
2.5.2 Bacterial strains 38
2.5.2.1 Glycerol strains 38
2.5.2.2 Agar plates 38
2.6 Growth of cells for expression of proteins 38
2.6.1 P. pastoris 38
2.6.2 S. cerevisiae 39
2.6.3 E. coli 39
2.6.3.1 When cells were not induced 39
2.6.3.2 Induction 39
2.7 Preparation of microsomes from yeast cells 40
2.8 Separation of plasma membranes and endoplasmic reticulum
from total membranes of S. cerevisiae 40___________________________________________________TABLE OF CONTENTS
2.9 Preparation of membranes from E. coli 41
2.10 Solubilization and purification of recombinant protein from
yeast microsmes 41
2.11 Solubilization of E. coli membranes 42
2.12 Purification by affinity chromatography 42
2.13 Gel filtration 43
2.14 Hydrophobic interaction chromatography 43
2.15 Protein estimation 43
2.16 Polyacrylamide gel electrophoresis 44
2.16.1 SDS-PAGE 44
2.16.2 Staining of gels 45
2.16.2.1 Coomassie staining 45
2.16.2.2 Silver staining 45
2.16.3 Western blot analysis of proteins 45
2.17 Preparation of total lipids of Aquifex aeolicus 46
2.18 Preparation of lipid vesicles for activity assays 46
2.19 Solubilization of lipids 47
2.20 Thin layer chromatography 47
2.21 Reconstitution of proteins in lipid vesicles 47
2.22 2D crystallization 48
2.22.1 Dialysis 48
2.22.2 Biobeads 48___________________________________________________TABLE OF CONTENTS
2.22.3 Electron microscopy 48
2.22.3.1 Negative staining 48
2.22.3.2 Cryo-electron microscopy 49
2.22.3.3 Image collection 49
2.22.3.4 Image processing 49
2.23 3D crystallization 50
2.23.1 Robotic (sitting drop method) 50
2.23.2 Manual (hanging drop method) 50
2.24 ATP hydrolysis assay 50
CHAPTER 3 RESULTS 53
3.1 Pichia pastoris as an expression system for production of
AHA2 53
3.1.1 Cloning of AHA2 plasmid in P. pastoris 53
3.1.2 Expression analysis of 9K-AHA2 and 35K-AHA2 53
3.2 Over-expression of AHA2 in S. cerevisiae 55
3.2.1 Expression and purification 55
3.2.2 Hydrophobic interaction chromatography 56
3.2.3 Separation of plasma membrane and endoplasmic
reticulum fractions of S. cerevisiae membranes 57
3.2.4 Electron Microscopy 58
3.3 Cloning of copper ATPases from A. aeolicus in E. coli 60
3.4 CtrA3 62
3.4.1 Expression of CtrA3 62___________________________________________________TABLE OF CONTENTS
3.4.2 Solubilization and purification 63
3.4.3 Gel filtration 64
3.4.4 Activity assays 65
3.4.4.1 Activity in presence of different metal ions 65
3.4.4.2 Activity at different temperatures 66
3.4.4.3 Activity at different pH 67
3.4.4.4 Activity in the presence and absence of lipids 68
3.4.4.5 Saturation of activity 69
3.4.4.6 Cysteine dependence of CtrA3 71
3.4.4.7 Effect of NaCl on activity of CtrA3 71
3.4.5 Analysis of A. aeolicus lipids 72
3.4.6 Reconstitution of CtrA3 in lipids 74
3.4.7 2D Crystallization and uranyl acetate staining 75
3.4.8 Cryo-microscopy and image processing 77
3.4.9 3D crystallization 78
3.5 CtrA2 80
3.5.1 Expression of CtrA2 80
3.5.2 Solubilization and purification 80
3.5.3 Gel filtration 81
3.5.4 Activity assays 81
3.5.4.1 Activity in presence of different metal ions 81
3.5.4.2 Activity at different temperatures 82
3.5.4.3 pH dependence of CtrA2 84

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