Expression and in vitro characterisation of human Granzyme B-based immunotherapeutics for specific targeting of CD64+ malignancies [Elektronische Ressource] / Bettina Stahnke

Ulli Weigel

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• Publié par: rheinisch-westfalischen_technischen_hochschule_-rwth-_aachen
• Publié le: 01 janvier 2011
• Nombre de lectures: 24
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

Expression and in vitro characterisation of
human Granzyme B-based
immunotherapeutics for specific targeting
+of CD64 malignancies
Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften
der RWTH Aachen University
zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Diplom-Biologin
Bettina Stahnke
aus Frankfurt am Main
Berichter: Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Rainer Fischer
Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Dr. rer. medic. Stefan Barth
Tag der mündlichen Prüfung: 28. März 2011
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.Content
1 Introduction . .. . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . .. . . .. .. . . . .. .. . . .. . .. . .. . . . .. . .. . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . .. .. . .. .. . . . .. . . .. . .. . . . .. . 8
1.1 Cancer . .. . .. .. . . . . .. . .. .. . .. . .. .. . . .. .. . . .. . . .. . . .. . . . . . . .. . . .. . . . . . . .. . . .. .. .. .. .. .. .. .. . . .. . . .. . . .. . . . . . . .. . . . .. . . .. . 8
1.2 Acute myeloid leukaemia .. . . . . . . .. .. . .. .. . .. . . . .. . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. .. . . . . .. . .. .. . . . . .. . .. . . . . . . . .. . 8
1.3 Immunotoxins .. . .. . . . . . . . . .. . .. . . . .. . . . . . . . . .. . . .. . . .. . . . . . . . .. .. . . . . . . .. .. .. . . . . . .. . . . . . . . . .. . .. . .. .. . . . . . . . . .. .. 10
1.3.1 Immunotoxins against AML . . .. . . . .. . . . . . . . . .. . .. .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . .. . . . . .. .. . . .. .. . . .. .. . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. 11
1.3.2 Optimisation of immunotoxins . .. . . . . . .. . . . .. .. . . . .. . .. .. . . . . . .. . . . .. . . .. . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . .. . . . . .. . . . . . . . . .. 12
1.4 CD64 . .. .. . . .. . .. . . .. . .. . .. . .. . . . .. . . . . .. .. . . . .. . . . . .. . .. . . . .. . . . .. . . .. . . . .. . .. . . .. . .. .. .. . .. . . .. .. . . .. . . .. . .. . .. . . . . .. 14
1.5 Granzyme B . . . . .. . .. . . .. .. . . . . .. .. . . .. . . . . .. . . . . . .. .. .. . . . .. .. . . . .. . . . . .. . .. . . . . .. . .. . . . . . .. .. . . .. . .. . . . .. .. . . . . .. 15
1.6 Recombinant expression of therapeutic proteins . . . .. . . . . . . . . . . .. .. .. . .. . . . . .. . .. .. .. . . . . . .. . . 16
1.6.1 Microbial expression . . . .. . . .. .. . . .. . . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . .. . . .. . . .. . . . . .. .. . .. . . .. . . .. . . . . .. . . . . . . . . .. . .. . . . . .. . .. . . . . . . .. . . . . .. 16
1.6.2 Mammalian expression . .. . . . .. .. . . . . .. . . . . . . .. . . . .. . . .. . . .. . . . . .. .. . . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . .. . .. . . .. . . . .. .. . . . . .. 17
1.6.3 Plant expression .. . . .. . . . . . . . . .. . .. . .. . . .. . . . . .. . .. .. .. . . . . .. .. . . . . . . .. . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . . .. . . .. . . . . . . .. . .. . . . .. .. . . .. 19
1.7 Aim of the thesis . .. . . . .. . . . . . . . .. .. .. . . . .. .. . . .. . . .. . . . .. . .. .. .. . . . . . . . . . . . .. . . .. . .. . .. .. . . . .. . . .. . .. . . . .. . . . . .. 20
2 Materials and Methods . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . .. . . .. .. . . . . . . . .. . . . . . . .. .. . . . . .. .. . . .. . . . . . . . . . . . . .. 23
2.1 Materials . . .. . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . .. . .. .. . . .. . . .. . .. . . . . .. . .. .. .. .. . .. . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . .. . . . . .. .. . . . . . . .. 23
2.1.1 Chemicals and consumables . .. . . . . . . .. . . . .. . .. . . . .. . .. . . . .. .. . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . .. . .. .. . .. . . . . .. . . . . . . .. .. . . . . . . .. . . . . .. 23
2.1.2 Buffers and media . . . .. .. . . . . . . . . . . . . .. .. . . .. . . . . . . .. . .. . . . . . . . .. .. . . . .. . . . .. . .. . .. .. . .. . . . . .. .. . .. . . .. . . . . . . .. .. . . . .. . . . .. .. . . .. 23
2.1.3 Antibodies .. . .. .. . . . . . . . .. . . .. . . . .. . . .. .. . . .. .. .. . . .. . . . . . .. .. .. . . . .. .. . . . .. . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . .. . .. . . . .. . . . .. . .. . . . . . . .. . . . . .. 25
2.1.4 Enzymes and reaction kits . . .. . .. . . . . .. . . .. . . .. .. . . . .. . . . . . . . . .. . . .. . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . 26
2.1.5 Synthetic oligonucleotides . . .. . . . . . . . . .. . . .. . . . . .. . . . . . .. . . .. . . .. . . .. . . .. .. .. .. . . . .. . . .. . . . .. .. . .. . . . . .. . .. . .. .. . . .. .. . . . . .. 27
2.1.6 Bacterial and plant strains and human cell lines . . . . . .. . .. . . . . . .. . . . . . .. . . .. . . . . . . . . . .. . . . .. . . .. . .. . .. . .. . . . . . . .. 28
2.1.7 Primary cells .. . . . . . . . . . . .. . . . .. .. . . . . .. . . .. . . .. . . . . . . .. . . .. . . .. . . .. . . . . .. .. . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . .. . . . . . . .. . . .. . . . . .. . . . . . . .. . 28
2.1.8 Plasmid vectors . . .. .. .. . . . . . . .. . .. . . . . . .. . . . . .. . .. . . . . . .. .. . . . .. . . . .. . . . . . . . . . .. . . . .. . . .. . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . .. . .. . . . . .. . . . .. .. .. . 29
2.1.9 Synthetic genes .. . . . . . . .. . . . .. .. .. . . . .. . . . . . . . .. . .. . .. . . .. . . . . .. . . .. . . .. . . . .. . .. . . .. .. . .. . . . . . . . . . . .. . . . . .. .. . . . . . . .. . .. . . . . .. .. .. 29
2.2 Methods . . . .. . . . .. . . .. . . . . . . .. . . . .. . .. . . . . . .. . . .. . . . . . .. . . .. . . .. . .. .. . .. .. . . .. . . .. . . . . . . . . . .. . . .. . . .. . .. . .. . . . . . . . . .. 30
2.2.1 Production and preparation of DNA . . .. .. . .. . . . . . .. . . . . . .. . .. . .. . . . . . .. . . . . . .. .. . . .. . .. . . . . .. . . . .. . .. . .. . . . . . . .. . . . . . .. 30
2.2.1.1 Minipreparation of plasmid DNA from E. col i. . . .. . . . .. . .. . . . .. . . . . . . . .. . . . .. . . . .. . . .. . . . . .. . . .. . . . . . . . . . . . . 30
2.2.1.2 Photometric determination of the concentration of nucleic acid solutions . . .. . . . .. .. . . .. . .. . . 30
2.2.1.3 Restriction endonuclease digest of DNA . .. .. . .. . . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . .. .. . .. . 30 Content 4
2.2.1.4 Agarose gel electrophoresis .. .. .. . . . . .. . .. . .. . .. . .. . .. . . .. .. .. . . . . .. . .. . . . . . . .. . . . . . .. .. . . . . .. .. . . .. .. . . . . . . . .. . . . .. 31
2.2.1.5 Ligation of DNA fragments . .. . . .. . . . . . . . . . . . . .. . .. .. . .. . . . .. . . .. . .. . . .. . .. .. . . . . . . . .. .. . . .. .. . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . .. . 31
2.2.1.6 Production of heat shock competent E. col i . .. . . .. . .. . .. . . . . .. . . . . .. .. . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . .. . . . . .. .. . . . . .. 31
2.2.1.7 Heat shock transformation of competent E. col i . . . . .. . . . .. . . . . . . . .. . .. .. . .. . . . .. .. . . .. .. . .. . . . . . . . . . . . . . .. 31
2.2.1.8 Polymerase chain reaction (PCR) . .. . .. . . . . . . . .. . . . .. .. . . . . .. . .. . . . . . . . .. . . . . .. .. . .. . . .. . .. . .. . .. . . . . . . .. . . . . .. . . 32
2.2.1.9 Sequencing of final constructs . .. . . . . . . .. . . . .. .. . .. . .. . . . .. .. . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . .. .. . .. . . . . . . .. . .. . . .. . . . . . .. . . .. . 33
2.2.1.10 Preparation of E. col i glycerol stocks . .. . . . .. .. . . . . . . . . .. .. . . .. .. . . . .. . . . . . . .. . .. . . . . .. . . . . . . . . . .. .. . .. . . . . . .. 33
2.2.2 Production of recombinant protein in E. col i .. .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . .. . . . .. .. . .. . . .. . . . . . . . . . .. . .. . . . .. . . . .. . . . . .. 34
2.2.2.1 Cultivation and lysis of E. col i Rosetta or E. col i BL21(DE3) .. .. . . .. . . . . . .. . . .. . .. . . . . .. . . . . . . . . .. . . 34
2.2.3 Production of recombinant protein in N. tabacum . .. . . .. . .. . .. . . . . .. . . .. . . .. . . . .. . .. . . . . . .. . .. . . . . .. . . .. . . .. . . . . 34
2.2.3.1 Transformation of competent A. tumefaciens .. .. . . . . . . . . .. .. .. . . . .. . .. . . . .. . .. . . . .. . . .. . .. .. . .. . . . . . . . .. . . . 34
2.2.3.2 Preparation of A. tumefaciens glycerol stocks . .. . . .. .. .. . . . . . .. . .. .. .. . .. . . . .. . . .. . .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .. 34
2.2.3.3 Syringe infiltration of N. tabacum