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Forces are able to set position and timing of microtubule catastrophes in fission yeast [Elektronische Ressource] / presented by Dietrich Foethke

De
172 pages
DissertationsubmittedtotheCombinedFacultiesfortheNaturalSciencesandforMathematicsoftheRuperto CarolaUniversityofHeidelberg,GermanyforthedegreeofDoctorofNaturalSciencespresentedbyDiplom Physiker DietrichFoethkebornin: Göttingenoralexamination: .................ForcesAreAbleToSetPositionAndTimingOfMicrotubuleCatastrophesInFissionYeastReferees: PDDr. KarstenRippeDr. EricKarsentiAbstractInthefissionyeastSchizosaccharomycespombe,interphasemicrotubulesswitchtodepolymerizationalmostexclusivelyatthepolesofthecylindricalcell. Properlocalizationoftheseeventsiscrucialformorphogenesis, and is thought to depend on factors preferentially localized at the cell poles. Usingcomputersimulationsweanalyzedfivedifferentmodelsofhowmicrotubuledynamicinstabilitymightbe regulated in order to reproduce the organization of microtubules observed in vivo. To evaluate thesimulationswecomparedtheiroutputtoninetraitsofinterphasecells. Usingthesimulationwecouldshow that the shape of fission yeast induces forces on microtubule plus ends specifically at the cellpoles. We found that the effect of these forces on microtubule dynamics was sufficient to reproducethe nine traits without the requirement of pole specific factors. In vivo experiments with mutant cellsconfirmedthatcellshapeisessentialfortheproperorganizationofmicrotubulesinfissionyeastwhichindicatesthatforcemightalsoberelevantinlivingcells.
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Dissertation
submittedtothe
CombinedFacultiesfortheNaturalSciencesandforMathematics
oftheRuperto CarolaUniversityofHeidelberg,Germany
forthedegreeof
DoctorofNaturalSciences
presentedby
Diplom Physiker DietrichFoethke
bornin: Göttingen
oralexamination: .................ForcesAreAbleToSet
PositionAndTimingOf
MicrotubuleCatastrophesInFissionYeast
Referees: PDDr. KarstenRippe
Dr. EricKarsentiAbstract
InthefissionyeastSchizosaccharomycespombe,interphasemicrotubulesswitchtodepolymerization
almostexclusivelyatthepolesofthecylindricalcell. Properlocalizationoftheseeventsiscrucialfor
morphogenesis, and is thought to depend on factors preferentially localized at the cell poles. Using
computersimulationsweanalyzedfivedifferentmodelsofhowmicrotubuledynamicinstabilitymight
be regulated in order to reproduce the organization of microtubules observed in vivo. To evaluate the
simulationswecomparedtheiroutputtoninetraitsofinterphasecells. Usingthesimulationwecould
show that the shape of fission yeast induces forces on microtubule plus ends specifically at the cell
poles. We found that the effect of these forces on microtubule dynamics was sufficient to reproduce
the nine traits without the requirement of pole specific factors. In vivo experiments with mutant cells
confirmedthatcellshapeisessentialfortheproperorganizationofmicrotubulesinfissionyeastwhich
indicatesthatforcemightalsoberelevantinlivingcells.
We furthermore applied the simulation to study the organization of microtubules in mutant cells
that were deleted of the microtubule tip tracking proteins Mal3 and Tip1. This lead to the proposal
of a novel hypothesis how Tip1 might function in vivo to assist force in the discrimination of the cell
polesfromcentralpartsofthecellcortex.
Zusammenfassung
InInterphasedepolymerisierendieMikrotubuliderHefeSchizosaccharomycespombefastausschließ
lichandenPolenderzylindrischenZelle. DiegenauePositionierungdieserVorgängeistentscheidend
für die Morphogenese der Zelle und es wird angenommen, dass Faktoren am Zellende dafür ver-
antwortlich sind. Mit Hilfe von Computer Simulationen wurden in dieser Arbeit fünf verschiedene
Modelle für die Regulierung der Dynamischen Instabilität von Mikrotubuli daraufhin untersucht wie
gut sie die Organisation von Mikrotubuli in Wildtyp Zellen reproduzieren. Zur Auswertung wurden
die Ergebnisse der Simulationen mit neun charakteristischen Eigenschaften von Wildtyp Zellen ver-
glichen. Wir konnten zeigen, dass aufgrund der zylindrischen Form von S. pombe Kräfte auf die
Mikrotubuli wirken, die vor allem an den Polen der Zelle auftreten. Simulationen, die den Einfluss
dieser Kräfte auf die Dynamische Instabilität von Mikrotubuli berücksichtigten, stimmten mit den
neun gemessenen Eigenschaften von Wildtyp Zellen überein. Weitere Faktoren an den Polen der
Zelle wurden nicht benötigt. In vivo Experimente mit Mutanten bestätigten, dass die Form der Zelle
von entscheidender Bedeutung für die Organisation der Mikrotubuli ist. Dies deutet darauf hin, dass
KräfteaufMikrotubuliauchinlebendenZellenrelevantsind.
DieSimulationwurdeweiterhinverwendet,umdieOrganisationvonMikrotubuliinMutantenzu
untersuchen,indenendieGenefürdieProteineMal3undTip1ausgeschaltetwurden. UnsereErgeb
nisse geben Hinweise darauf wie Tip1, zusätzlich zur Kraft, an der Regulierung der Dynamischen
InstabilitätvonMikrotubulibeteiligtseinkönnte.Contents
1 Introduction 5
1.1 PolarizationandMorphogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 TheCytoskeleton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.1 DynamicInstabilityandTreadmilling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2.1.1 TheNTP capmodel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2.1.2 StructuralModelforMicrotubuleDynamicInstability . . . . . . . 14
1.2.2 Actin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.2.3 IntermediateFilaments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.2.4 Microtubules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.2.4.1 MechanicalProperties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.2.4.2 MicrotubuleCompositionandStructure . . . . . . . . . . . . . . 21
1.2.4.3ulePolarityandNucleation . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.2.4.4 DrugsandMAPsRegulateMicrotubuleDynamics . . . . . . . . . 25
1.2.4.5 TheTipTrackingProteinsEB1andCLIP170 . . . . . . . . . . . 27
1.2.4.6 MotorProteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
1.3 TheFissionYeastSchizosaccharomycespombe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
1.3.1 TheCellCycle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
1.3.2 TheFissionYeastCytoskeleton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
1.3.2.1 Actin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
1.3.2.2 MicrotubuleBundlesinInterphase . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
1.3.2.3 TheTip trackingProteinsMal3andTip1 . . . . . . . . . . . . . . 42
1.3.3 PolarizationandMorphogenesisinS.pombe . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
1.4 ComputerSimulationsandExperiments-
ACombinedApproachtoInvestigateMicrotubuleDynamics . . . . . . . . . . . . . 47
2 SimulatingMicrotubuleDynamicsin Schizosaccharomyces pombe 49
2.1 SetupoftheSimulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.2 SimulationMethods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.2.1 ConstrainedLangevinDynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.2.2 NumericalIntegration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.2.3 Microtubules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.2.3.1 BendingElasticity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.2.3.2 InterpolationofIntermediatePoints . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.2.3.3 FirstorderConstrainedDynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.2.3.4 MobilityofMicrotubulePoints . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.2.3.5 BrownianMotionofMicrotubules . . . . . . . . . . . . . . . . . 542 CONTENTS
2.2.4 TheNucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.2.4.1 MobilityoftheNucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.2.4.2 BrownianMotionoftheNucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.2.5 Confinement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.2.6 InteractionsBetweenSimulatedObjects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.2.6.1 MicrotubuleBundles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.2.6.2 AttachmentofMicrotubuleBundlestotheNucleus . . . . . . . . 58
2.2.6.3 Microtubule NucleusStericInteractions . . . . . . . . . . . . . . 58
2.2.7 DynamicInstabilityofMicrotubules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.2.8 LifeatLowReynoldsNumber . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
2.2.9 OntheRoleofInertiaWithintheCytoplasm . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3 NineTraitsofWildTypeInterphaseFissionYeastCells 65
3.1 T1: AlignmentofMicrotubuleBundles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.2 T2: ActiveCenteringoftheNucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.3 T3: VarianceoftheNucleusPosition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.4 T4: MicrotubuleCurling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.5 T5: CatastrophesatCellPoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.6 T6:attheCortex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
3.7 T7: MicrotubuleContactTimeatCellPoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
3.8 T8: NumberofHalf BundlesTouchingthePoles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.9 T9: MicrotubuleBundleLength . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4 FiveModelsfortheRegulationofMicrotubuleDynamicInstability 73
4.1 Model1: IndependentMicrotubuleDynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.1.1 MicrotubuleLengthDistribution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.1.2 LengthDistributionofMicrotubuleBundles . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.1.3 ParametersforSimulationsWithIndependentDynamics . . . . . . . . . . . 77
4.2 Model2: LimitedTubulinConcentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.33: LocalizedCatastrophes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.4 Model4: ForceDependentGrowthVelocity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.55: ForceMicrotubuleDynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.6 SummaryofModelParameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5 Results 85
5.1 AnalyzingFiveModelsfortheRegulationofDynamicInstability . . . . . . . . . . 85
5.1.1 ResultsModel1: IndependentMicrotubuleDynamics . . . . . . . . . . . . 87
5.1.22: LimitedTubulinConcentration . . . . . . . . . . . . . . . 93
5.1.3 ResultsModel3: LocalizedCatastrophes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
5.1.44: ForceDependentGrowthVelocity . . . . . . . . . . . . . 99
5.1.5 ResultsModel5: ForceMicrotubuleDynamics . . . . . . . . . . 101
5.2 TheRelevanceofCellShapeandForceInVivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
5.2.1 MutantsinPmo25areDefectiveinPolarizedGrowth . . . . . . . . . . . . . 103
5.2.2 MicrotubuleOrganizationinthePmo25Mutant . . . . . . . . . . . . . . . . 104
5.3 ForceDependentMicrotubuleDynamicsinMutantCells . . . . . . . . . . . . . . . 109
5.3.1 SimulatingthePhenotypeofMal3Deletion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
5.3.2theofTip1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112CONTENTS 3
6 DiscussionandOutlook 119
Appendix 127
A ParametersoftheSimulation 127
A.1 CellSize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
A.2 StiffnessoftheCortex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
A.3 ViscosityoftheCytoplasm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
A.4 RadiusoftheNucleus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
A.5 Mobilityof“Buoys”intheNuclearMembrane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
A.6 Microtubule NucleusStericInteraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
A.7 StiffnessofMicrotubule NucleusLinks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
A.8 MicrotubuleDynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
A.8.1 FreeGrowthVelocity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
A.8.2 ShrinkageVelocity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
A.8.3 FreeCatastropheRate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
A.8.4 RescueRate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
A.9 MicrotubuleResponsetoForce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
A.9.1 FlexuralRigidityofMicrotubules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
A.9.2 SensitivitytoForce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
A.9.3 CatastropheRateforStalledMicrotubules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
A.10 MicrotubuleBundles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
A.10.1 NumberofBundles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
A.10.2 BundleStructure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
A.11 NumericalParameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
B ResultsoftheVariationofv andc fortraitsT2-T9 1410 0
C TheDistributionofMicrotubuleLengthforIndependentDynamics 145
C.1 AverageMicrotubuleLength . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
C.2 LengthDistributionIntheBoundedRegime . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
D ExperimentalMaterials&Methods 147
D.1 YeastStrainsandMedia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
D.2 ActinStaining . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
D.3 Time CourseofCellsExpressingGFP tubulin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
D.4 Time LapseImagingandImageAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Bibliography 149

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