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Functional characterization of Lupli, a new component of the oskar RNP complex in the Drosophila oocyte [Elektronische Ressource] / presented by Lukas Neidhart

111 pages
Functional characterization of Lupli, a newcomponent of the oskar RNP complex inthe Drosophila oocyteLukas NeidhartSeptember 2007 Dissertation submitted to the Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by Lukas Neidhart (Diploma in Biology) Born in Boston (MA), USA Oral Examination: October 26, 2007 Functional characterization of Lupli, a new component of the oskar RNP complex in the Drosophila oocyte Referees: Dr. Darren Gilmour Prof. Dr. G. Elisabeth Pollerberg Contents1 Introduction 111.1 RNA localization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111.1.1 Different functions in different systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111.1.2 Mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131.2 Drosophila oogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151.3 Axis determination in Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161.3.1 Establishment of the antero-posterior axis by gurken . . . . . . . . . . . . . 191.3.2 Determination of the dorsal-ventral axis by gurken . . . . . . . . . . . . . . 201.3.3 Determination of the anterior-posterior axis by bicoid . . . . . . . . . . . . 211.3.4 Biological role of Oskar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Functional characterization of Lupli, a new
component of the oskar RNP complex in
the Drosophila oocyte
Lukas Neidhart
September 2007
Dissertation

submitted to the
Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of Doctor of Natural Sciences









presented by
Lukas Neidhart (Diploma in Biology)
Born in Boston (MA), USA
Oral Examination: October 26, 2007


Functional characterization of Lupli, a new
component of the oskar RNP complex in the
Drosophila oocyte





Referees:
Dr. Darren Gilmour
Prof. Dr. G. Elisabeth Pollerberg
Contents
1 Introduction 11
1.1 RNA localization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.1.1 Different functions in different systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.1.2 Mechanisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.2 Drosophila oogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.3 Axis determination in Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.3.1 Establishment of the antero-posterior axis by gurken . . . . . . . . . . . . . 19
1.3.2 Determination of the dorsal-ventral axis by gurken . . . . . . . . . . . . . . 20
1.3.3 Determination of the anterior-posterior axis by bicoid . . . . . . . . . . . . 21
1.3.4 Biological role of Oskar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.4 oskar mRNA localization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.4.1 oskar mRNA distribution during oogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.4.2 The MT cytoskeleton, motor proteins and oskar RNP transport . . . . . . 24
1.4.3 The actin cytoskeleton and oskar mRNA anchoring . . . . . . . . . . . . . 28
1.4.4 cis-acting elements, trans-acting proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.5 Aim of thesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2 Material and Methods 35
2.1 GFP-based protein trap screen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.1.1 Screening procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.1.2 Inverse PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.2 Drosophila genetics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.2.1 Fly husbandry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.2.2 Stocks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.2.3 Ectopic expression using the UAS/GAL4 system . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.2.4 Generation of germ line clones using the FLP-FRT and FLP-DFS systems . 37
2.3 Molecular Biology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.3.1 Single-fly PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.3.2 RNA isolation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.3.3 cDNA synthesis and RT-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
2.3.4 Cloning UASp-lupli-HA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.3.5 Primer list . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
C2.4 lupli generation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.5 Antibody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.5.1 Cloning and purification of Lupli protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.5.2 Injection and antibody purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2.6 Western blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
2CONTENTS CONTENTS
2.6.1 Phosphatase assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.7 RNA affinity pull-down . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.8 Immunostaining . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.8.1 Immunofluorescence staining of Drosophila egg chambers . . . . . . . . . . 49
2.8.2 Lupli immunostaining of egg chambers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.9 Software/Websites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3 Results 52
3.1 GFP-based protein trap screen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.1.1 Principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.1.2 Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.1.3 The Protein-trap consortium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.1.4 Observed patterns . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
3.1.5 Several lines with posterior enrichment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.1.6 Refining posteriorly enriched lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.1.7 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.2 Lupli, a novel RRM domain protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.2.1 GFP-trap line P64C9 shows a posterior enrichment in the oocyte . . . . . . 60
3.2.2 P64C9 is a Lupli::GFP fusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.2.3 lupli is conserved during evolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.2.4 RRM protein and function prediction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.3 Lupli distribution during oogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.3.1 Generation of anti-Lupli antibody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.3.2 Long Lupli is a phosphoprotein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.3.3 Lupli expression pattern during oogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.4 Lupli is a novel component of the oskar RNP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.5 Lupli associates with the oskar 3’ UTR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.6 Lupli function in oskar mRNA localization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
C3.6.1 lupli - an RRM-deletion mutant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.6.2 P element alleles of lupli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.6.3 oskar localization in lupli alleles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
3.6.4 Microtubule polarity is affected lupli mutants . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.6.5 lupli affects Oskar protein levels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4 Discussion 84
4.1 Limits of the protein trap approach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.2 Lupli - a component of the oskar RNP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.3 Phenotype . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
C4.3.1 Absence of phenotype in lupli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.3.2 Ectopic dot phenotype and MT polarity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
4.3.3 lupli and Oskar levels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
4.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
Bibliography 96
3List of Figures
1.1 Examples of localized mRNAs in different organisms and cell types . . . . . . . . . 12
1.2 Model for active mRNA transport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.3 Drosophila oogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.4 Oocyte specification in the germarium of Drosophila . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.5 Localization of gurken, bicoid and oskar mRNAs in the wild type oocyte . . . . . . 18
1.6 Establishment of the A/P axis by Gurken signalling . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.7 Antero-posterior patterning systems in the Drosophila egg . . . . . . . . . . . . . . 22
1.8 oskar mRNA localization during oogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.9 Different models proposed for oskar mRNA localization to the posterior pole of the
oocyte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.10 oskar mRNA localization phenotypes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.11 The EJC component Y14 colocalizes with Staufen at the posterior pole of the oocyte 30
1.12 Dynamics of oskar mRNA regulating factors from the nucleus to the posterior pole
of the oocyte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.1 Fly stocks used . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.2 UAS/GAL4 system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.3 The FLP-DFS system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.4 Primers used in this study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.5 Homologous recombination using the ends-out system . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.6 General crossing scheme for homologous recombination . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.1 Principle of GFP-based protein trap screen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.2 Layout of the Protein-trap database . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.3 GFP trap expression patterns in the ovary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.4 Lines displaying a posterior enrichment of GFP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.5 GFP expression pattern in P64C9 egg chambers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.6 Insertion of GFP into CG32423 in line P64C9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.7 lupli transcripts in the ovary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.8 Lupli protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.9 Lupli is the Drosophila ortholog of three mamalian RBMS proteins . . . . . . . . . 63
3.10 Sequence conservation of Lupli across evolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
3.11 Conservation of RRM domains in Lupli and its human orthologs . . . . . . . . . . 65
3.12 Generation and specificity of anti-Lupli antibody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.13 Long Lupli a phospho-protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
3.14 Lupli expression in the germarium and during early oogenesis . . . . . . . . . . . . 68
3.15 Endogenous Lupli localizes to the posterior of the oocyte together with oskar mRNA 69
4LIST OF FIGURES LIST OF FIGURES
3.16 Distribution of Lupli isoforms in the oocyte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3.17 The posterior enrichment of Lupli depends on oskar mRNA . . . . . . . . . . . . . 70
3.18 Colocalization of long Lupli-HA with Staufen in a gurken mutant oocytes . . . . . 71
3.19 Posterior enrichment of Lupli does not depend on Oskar protein . . . . . . . . . . . 72
3.20 Lupli binds biotinylated oskar 3’UTR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.21 lupli locus and mutants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
C3.22 lupli egg chambers show no defects in localization of osk-RNP . . . . . . . . . . 76
C3.23 A truncated long Lupli transcript is present in lupli . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3.24 lupli is required for proper localization of Staufen and Oskar at the posterior pole . 79
3.25 P64C9 is a lupli allele and displays the same phenotype as other lupli alleles . . . 80
3.26 lupli is required for oocyte polarity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.27 Oskar protein levels are reduced in lupli mutant ovaries . . . . . . . . . . . . . . . 82
3.28 Hatching rates of eggs laid by lupli mutant mothers are not affected . . . . . . . . 83
4.1 Mapping details of genes trapped by GFP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
4.2 A Potential GKS-3 phosphorylation site in the N-terminal of long Lupli is conserved 88
5LIST OF FIGURES LIST OF FIGURES
Abstract
mRNA localization is a common mechanism for targeting proteins to specific lo-
cations within a cell, and is crucial for establishment of cellular asymmetries. In
Drosophila, the two main body axis are determined by the localization of three ma-
ternal transcripts in the oocyte, bicoid, gurken, and oskar mRNA. oskar mRNA
localizes to the posterior pole of the oocyte where it is translated locally, which
is crucial for abdomen formation and germline development. Many of the factors
regulating this process have been identified by means of genetics, and the majority
of them colocalize with the oskar transcript at the posterior pole. However, the
precise mechanism of oskar mRNA localization is still not understood.
To gain further insight into the process ofoskar regulation, I aimed at identifying
novel components involved in this process. I participated in a protein-trap screen
where GFP fusions were randomly generated, and colocalization with oskar mRNA
at the posterior pole of the oocyte was scored. Several lines displaying an enriched
GFP signal at the posterior pole were identified. I characterized an independently
generated line, in which the gene identified encodes a novel RNA recognition motif
(RRM)-containing protein that I named Lupli. By immunostaining, I showed that
endogenous Lupli protein displays the same distribution pattern in the oocyte as
GFP::Lupli. Lupli associates with the 3’ UTR of oskar mRNA and is a component
of the oskar ribonucleoprotein (RNP) complex in vivo. I showed that the late
short-range transport of oskar mRNA to the cortex is defective in lupli mutant
oocytes at stage 9, and that the microtubule cytoskeleton is not properly polarized.
Furthermore, Oskar protein levels are reduced in lupli mutant ovaries. My work thus
led to the identification of Lupli as a new component of the oskar RNP complex,
and suggests that its function is required for proper localization and expression of
oskar in Drosophila oocytes.
6LIST OF FIGURES LIST OF FIGURES
Zusammenfassung
Die Lokalisierung von mRNA ist ein Mechanismus um Proteine gezielt in einer spez-
ifischen Region der Zelle zu exprimieren und somit zur Schaffung von zellulären
Asymmetrien beiträgt. In Drosophila werden die zwei Körperachsen durch die
Lokalisierung von drei verschiedenen Transkripten bestimmt: oskar, bicoid und
gurken. oskar mRNA lokalisiert am posterioren Pol der Oocyte, was essentiell ist für
die Bildung der Geschlechtszellen und des Abdomens. Die meisten Faktoren, die für
die Lokalisierung des oskar Transkripts benötigt werden, wurden durch genetische
Analysen identifiziert und kolokalisieren häufig mit der oskar mRNA am posterioren
Pol der Oocyte. Der genau Mechanismus der oskar mRNA Lokalisierung ist aber
nach wie vor unbekannnt.
Um diesen Mechanismus besser zu verstehen war die Zielsetzung, neue Faktoren
zu identifizieren, welche in diesem Prozess involviert sind. Dazu führte ich einen
visuellen Screen durch, wobei durch Moblisierung eines GFP-basierten Transposons
imGenomvonDrosophila chimäreGFP-Proteine(GFP:GrünFluoreszierendesPro-
tein)generiertwurden. DabeisuchteichspeziellnachDrosophila Linien, beiwelchen
eine Kolokalisierung vonoskar mRNA mit GFP am posterioren Pol der Oocyte stat-
tfand, und mehrere solcher Linien wurden identifiziert. Zusätzlich charakterisierte
ich eine vom Screen unabhängig generierte Linie, bei der GFP in ein bis dato nicht
charakterisiertes Gen eingefügt war. Dieses Gen wurde lupli benannt und kodiert
für ein RNA-Bindungsprotein. Antikörperfärbung bestätigte, dass das endogene
Lupli-Protein dasselbe Expressionsmuster besitzt, wie das chimäre GFP::Lupli. Lu-
pli assoziert mit dem 3’ untranslatierten Bereich (3’ UTR) der oskar mRNA und ist
eine neue Komponente des oskar RNP-Komplexes (RNP: Ribonucleoprotein). Ich
konnte zeigen, dass in lupli mutierten Oocyten währed des 9. Stadiums der Trans-
port des oskar Transkripts über eine kurze Strecke zum posterioren Cortex, sowie
die Polarisierung der Mikrobuli im Zytoskelett gestört sind. Im weiteren sinkt in
mutierten lupli Oocyten der Oskar-Proteinspiegel. Meine Arbeit führte zur Identi-
7LIST OF FIGURES LIST OF FIGURES
fizierung von Lupli, einer neuen Komponente des oskar RNPs, und suggeriert, dass
die Funktion von Lupli für die Lokalisierung, sowie für die Expression von oskar
erforderlich ist.
8