Functional characterization of modified vaccinia virus Ankara-encoded anti-apoptotic proteins [Elektronische Ressource] / Markus Lantermann

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• Publié par: johannes_gutenberg-universitat_mainz
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 125
• Langue: Deutsch
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Extrait

Functional characterization of Modified Vaccinia
Virus Ankaraencoded antiapoptotic proteins



Dissertation
zur Erlangung des Grades
“Doktor der Naturwissenschaften”
am Fachbereich Biologie
der Johannes GutenbergUniversität Mainz




Markus Lantermann
geboren in GroßGerau

Mainz, April 2009












Meiner Familie und Jessica













Danksagungen

An erster Stelle möchte ich mich bei Prof. Dr. Jürgen Markl für die Ermöglichung und
Begutachtung dieser Dissertation bedanken.

Ich danke Herrn Prof. Dr. Gerd Sutter für die Möglichkeit der Anfertigung meiner
Dissertation in seiner Forschungsgruppe am PaulEhrlichInstitut, für die wissenschaftliche
Unterstützung sowie vieler Tipps und Anregungen, die er mir in den letzten Jahren
zukommen ließ. Natürlich bedanke ich mich auch für die Begutachtung dieser Arbeit.

Frau Dr. Astrid Schwantes danke ich für die Betreuung und die kritische Auseinandersetzung
mit meiner Arbeit, die mich oft zu neuen Sichtweisen diverser Problemstellungen führte.

Frau Prof. Dr. Barbara Schnierle sei gedankt für ihren kritischen und weiterführenden Blick
auf meine Arbeit und ihre Unterstützung wann immer ich sie brauchte.

Nicht genug danken kann ich Karin Sperling für zahllose bereichernde Gespräche, Ideen und
Kritik. Danke dass du immer da warst, wenn ich mal Hilfe gebraucht habe.

Danke an alle Kollegen der Abteilung Virologie des PaulEhrlichInstituts für ihre fachliche
Hilfe und eine kurzweilige Zeit: Meike Gratz, Dr. Katja Sliva, Alexandra Pinczolitz, Joachim
Zwilling, Melanie Albrecht, Christine von Rhein, Madlen Dildey, Timo Schippers, Dr. Ulrike
Mettler, Dr. Thomas Preuß, Stefan Zimmerling, Christine Wrede, Robert Merget, Angela
Zeiler, Dr. Michael Lehmann, Daniela Müller, Yolanda MartinezFernandez, Melanie
Kremer, Dr. Yasemin Süzer, Matthias Hamdorf, Dagmar FechtSchwarz, Jasminka Geise und
KaiMartin Hanschmann.

Der größte Dank gilt meiner Familie und meiner Lebensgefährtin Jessica, ohne deren Liebe,
Verständnis und Unterstützung ich meinen bisherigen Weg nicht so hätte beschreiten können,
wie er hinter mir liegt.



Contents I
Contents

Contents I

Abbreviations VI

1 Summary 1

2 Introduction 3
2.1 Poxviruses 3
2.1.1 Taxonomy of the poxviridae 3
2.1.2 Structure and genomic organization 4
2.1.3 Viral life cycle 5
2.2 Modified Vaccinia Virus Ankara 8
2.2.1 Generation of MVA 8
2.2.2 Genome structure and viral gene expression profile 8
2.3 MVAinduced immune responses 9
2.4 MVAencoded inhibitors of apoptosis 10
2.4.1 Apoptotic pathways 11
2.4.2 Vaccinia virus antiapoptotic protein F1 12
2.4.3 The structural bcl2 homologue N1 13
2.5 MVAencoded immunoregulatory gene functions 15
2.5.1 The interferonresistance gene E3L as immune regulator 15
2.6 Aim of the thesis 17

3 Materials 19
3.1 Chemicals 19
3.2 Biochemicals 20
3.3 Anesthesia 21
3.4 Buffers and solutions 21
3.5 Kits 24
3.6 Enzymes 24
3.7 Synthetic oligonucleotides (Primers) 25
Contents II
3.8 Synthetic oligonucleotides (siR4A) 26
3.9 Plasmids 27
3.10 Synthetic peptides 27
3.11 Antibodies 27
3.12 Flourescent dyes 29
3.13 Viruses 29
3.14 Cell lines 30
3.15 Bacteria 30
3.16 Animals 30
3.17 Media 31
3.18 Consumables 32
3.19 Laboratory equipment 33

4 Methods 35
4.1 Cloning procedures using Escherichia coli 35
4.1.1 Transformation of plasmidDNA into competent E. coli 35
4.1.2 Plasmid purification from E. coli for analytical purpose (Miniprep) 35
4.1.3 High yield plasmid purification from E. coli (Maxiprep) 35
4.2 Cell culture 36
4.2.1 Cell culture conditions and cell split 36
4.2.2 Transient transfection of small interfering RNAs and plasmid DNA 36
4.3 Virological methods 37
4.3.1 In vitro virus infections 37
4.3.2 Generation of recombinant MVA 37
4.3.2.1 Infection and transfection of CEF cells 37
4.3.2.2 Transient hostrange selection of recombinant virus clones on
RK13 cells 38
4.3.2.3 Selection of K1Lfree virus clones 38
4.3.2.4 Amplification and purification of virus clones 38
4.3.2.5 Virus titration 39
4.4 D4A analysis 39
4.4.1 DNA sequencing 39
4.4.2 Analytical gel electrophoresis 39
4.4.3 DNA purification from agarose gels 39
Contents III
4.4.4 Restriction enzyme digestion 40
4.4.5 Determination of DNA concentration 40
4.4.6 Ligation 40
4.4.7 Preparation of DNA from vaccinia virus infected cells 40
4.4.8 Polymerase chain reaction (PCR) 41
4.5 R4A analysis 41
4.5.1 RNApreparation 41
4.5.2 Determination of RNA concentration 42
4.5.3 RNA gel electrophoresis 42
4.5.4 Northern blot 42
4.5.5 Construction of DIGlabeled RNAprobes 43
4.5.6 Functional control of generated DIGlabeled RNAprobes 43
4.5.7 Hybridization of membranebound RNA with DIGlabeled RNA
probes 44
4.5.8 Detection of RNA/RNAhybrids 44
4.6 Protein analysis 45
4.6.1 Generation of vaccinia virusspecific antibodies 45
4.6.1.1 AntiF1 antibody 45
4.6.1.2 AntiN1 antibody 45
4.6.2 Immunostain of vaccinia virusinfected cells 45
4.6.3 Western blot 46
4.6.3.1 Preparation of cell lysates 46
4.6.3.2 Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis
(SDSPAGE) 46
4.6.3.3 Wettransfer of proteins 46
4.6.3.4 Immunodetection of proteins on PVDF membranes 47
4.6.3.5 Immunodetection of proteins on nitrocellulose membranes using
the LiCor detection system 47
4.6.4.6 Stripping of PVDF and nitrocellulose membranes 48
35 4.6.4 [ S]metabolic labelling of proteins 48
4.6.5 FACS analysis of virusinduced apoptosis 48
4.6.6 βgalactosidase enzyme activity assay 49
4.6.6.1 Preparation of cell lysates 49
4.6.6.2 Determination of protein yield 49
Contents IV
4.6.6.3 βgalactosidase enzyme activity assay 50
4.7 In vivo and ex vivo analysis 50
4.7.1 Immunization of mice 50
4.7.2 Blood serum withdrawal 50
4.7.3 Determination of MVAspecific antibody titers 50
4.7.4 Quantification of vaccinia virusspecific T cell responses 51
4.7.4.1 Preparation of splenocytes 51
4.7.4.2 Determination of splenocyte cell count 51
4.7.4.3 Vaccinia virusspecific stimulation and staining of splenocytes 51
4.7.5 Analysis of protective capacity against a lethal ectromelia virus
challenge 52
4.8 Statistical analysis 53

5 Results 54
5.1 Impact of the antiapoptotic vaccinia virus protein F1 on MVA
immunogenicity 54
5.1.1 Molecular characterization of MVANF1L 54
5.1.2 MVANF1L induces apoptosis in murine cells 56
5.1.3 Induction of humoral immune responses by MVANF1L 58
5.1.4 MVANF1L immunization effectively primes VACVspecific Tcell
responses 59
5.1.5 Protective capacity of MVANF1L against lethal poxvirus infections 62
5.2 Functional characterization of the 41L ope n reading frame encoded
66 by MVA
5.2.1 Generation and characterization of MVA variants encoding for
different N1 proteins 66
5.2.1.1 Plasmids used for the generation of recombinant MVA with
modified N1L ORF 66
5.2.1.2 Generation of MVANN1L 68
5.2.1.3 Generation of revertant viruses MVAN1L and MVA rev
WRN1L 70 rev
5.2.1.4 Growth analysis of recombinant MVA 73
5.2.1.5 Antiapoptotic function of N1 75
5.2.1.6 N1L expression after viral infection 76
Contents V
5.2.2 Expression of N1 variants after transfection 78
5.2.2.1 Construction of plasmids expressing N1 variants 78
5.2.2.2 Expression of N1 variants 79
5.3 Influence of the doublestranded R4Abindi ng protein E3 on