Functional characterization of the ArcA and HlyX regulons of Actinobacillus pleuropneumoniae [Elektronische Ressource] / von Falk Fritz Reinhold Büttner

Falk Fritz Reinhold Büttner

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2008
• Nombre de lectures: 45
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 24 Mo

Extrait

Functional characterization of the ArcA and HlyX regulons
of Actinobacillus pleuropneumoniae



Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades eines



Doktors der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.



genehmigte Dissertation
von



Diplom-Biochemiker Falk Fritz Reinhold Büttner
geboren am 10.12.1978, in Rinteln





Hannover 2008 Referenten des Hauptfachs Mikrobiologie


Referent: Prof. Dr. med. vet. Gerald-Friedrich Gerlach
Institut für Mikrobiologie
Zentrum Infektionsmedizin
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover


Korreferentin: PD Dr. rer. nat. Christine Josenhans
Institut für medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene
Zentrum Laboratoriumsmedizin
Medizinische Hochschule Hannover


Prüferin des Nebenfachs (Biochemie) der Disputation

Prof. Dr. rer. nat. Rita Gerardy-Schahn
Institut für Zelluläre Chemie
Medizinische Hochschule Hannover


Prüfungsvorsitzender der Disputation

Prof. Dr. rer. nat. Georg Auling
Institut für Mikrobiologie
Leibniz Universität Hannover






Tag der Promotion: 26.02.2008

Erklärung zur Dissertation


Hiermit versichere ich an Eides statt, dass die Dissertation


Functional characterization of the ArcA and HlyX regulons of
Actinobacillus pleuropneumoniae



selbständig verfasst und alle benutzten Hilfsmittel sowie evtl. zur Hilfeleistung
herangezogene Institutionen vollständig angegeben wurden.


Die Dissertation wurde nicht schon als Diplom- oder ähnliche Prüfungsarbeit
verwendet.


Hannover, den



____________________________
(Unterschrift Falk Büttner)










Imagination is more important than knowledge,
for knowledge is limited while imagination embraces
the entire world


Albert Einstein
(1879 – 1955)
























Meinen Eltern







Acknowledgements

I wish to thank,

my supervisor Prof. Dr. Gerald-Friedrich Gerlach for the idea of this project, for his constant guidance
and for his permanent readiness to answer questions and to discuss scientific concerns. Further more,
I’d like to thank him for sharing his motivating enthusiasm about science.

PD Dr. Christine Josenhans for her kind offer to evaluate this thesis.

Dr. Janine Bosse from the Imperial College of Science, London for her guidance on performing
microarray analyses and for a nice time in London.

Armgard Janczikowski from the Leibniz University Hannover for doing the electron microscopy.

TMProf. Dr. Georg Auling from the Leibniz University Hannover for letting me use the Typhoon scanner
in his institute.

my past and present coworkers in our group and at the Institute for Microbiology, in particular: Nina
Baltes, Ibrahim Bendallah, Vitaliy Bolotin, Jonathan Braun, Karla Dreckmann, Julia Heinzmann, Ilse
Jacobsen, Dennis Kahlisch, Alexander Maas, Jochen Meens, Jörg Merkel, Shamoon Naseem,
Thomas Rehm, Meike Sack, Martin Selke, Janine Stratmann-Selke, Halina Tegetmeyer, Mathias
Weigoldt.

Dr. Dieter Markowski from GE Healthcare who was my contact person whenever proteomics failed.

all the members of the DFG Graduate College 745 “Mucosal-Host-Pathogen-Interactions” for the nice
comradeship.

Prof. Dr. Beate Sodeik who cultivated my scientific interest.

my girl friend Nadine for her patience when I stayed long in the lab and for her loving support.






Danksagung

Ich möchte mich bedanken bei,

meinem Betreuer Herrn Prof. Dr. Gerlach für den Anstoß zu dieser Arbeit und die intensive Betreuung
meines Projektes. Insbesondere danke ich auch dafür, dass er stets bereit war, meine Fragen zu
beantworten und wissenschaftlich relevante Thematiken ausführlich zu diskutieren. Mein Dank gilt ihm
auch für die angenehme Arbeitsatmosphäre, die Bereitstellung kostenintensiver Geräte und
Materialien und nicht zuletzt für seinen mich in besonderer Weise motivierenden Einsatz bei der
Bearbeitung wissenschaftlichen Neulandes.

Frau PD Dr. Josenhans für die freundliche Bereitschaft zur Evaluierung dieser Doktorarbeit.

Frau Dr. Bosse vom Imperial College of Science, London für ihre Betreuung bei der Durchführung der
microarray Experimente und dafür, dass sie mich bei meinem Aufenthalt in London so herzlich
aufgenommen hat.

Frau Janczikowski von der Leibniz Universität Hannover für die Elektronenmikroskopie.

Herrn Prof. Dr. Auling von der Leibniz Universität Hannover dafür, dass ich in seinem Institut den
TMTyphoon Scanner benutzen durfte.

meinen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern im Institut für Mikrobiologie, insbesondere: Nina
Baltes, Ibrahim Bendallah, Vitaliy Bolotin, Jonathan Braun, Karla Dreckmann, Julia Heinzmann, Ilse
Jacobsen, Dennis Kahlisch, Alexander Maas, Jochen Meens, Jörg Merkel, Shamoon Naseem,
Thomas Rehm, Meike Sack, Martin Selke, Janine Stratmann-Selke, Halina Tegetmeyer, Mathias
Weigoldt.

Herrn Dr. Markowski von GE Healthcare, weil er immer dann herhalten musste, wenn irgendetwas mit
der zweidimensionalen Gelelektrophorese nicht funktionierte.

all meinen Kollegen des DFG Graduierten Kollegs 745 “Mucosal-Host-Pathogen-Interactions” für die
gute Kameradschaft.

Frau Prof. Dr. Sodeik dafür, dass sie mein wissenschaftliches Interesse in besonderer Weise geweckt
und gefördert hat.

meiner Freundin Nadine, für ihre Geduld, wenn ich beim Forschen die Zeit vergaß, und dafür, dass sie
mich immer so liebevoll unterstützt hat. Zusammenfassung

Funktionelle Charakterisierung der ArcA- und HlyX-Regulons von A. pleuropneumoniae


Das gram-negative Bakterium Actinobacillus ( A.) pleuropneumoniae ist der Erreger der
Porcinen Pleuropneumonie. Die Anpassung der Genexpression an anaerobe Bedingungen ist
eine virulenzassoziierte Eigenschaft von A. pleuropneumoniae und erfolgt durch HlyX (das FNR-
Homolog von A. pleuropneumoniae) und das ArcAB Zweikomponentensystem. Ziel dieser Arbeit
war die Identifizierung der ArcA- und HlyX- Regulons und deren Bedeutung für die Virulenz.
Das arcA-Gen von A. pleuropneumoniae wurde identifiziert, deletiert und die Mutante durch
PCR, PFGE, Southern Blot und DNA-Sequenzierung überprüft. A. pleuropneumoniae ΔarcA
zeigte weder einen Wachstumsdefekt noch ein reduziertes Überlebensvermögen. A.
pleuropneumoniae bildete bei anaerobem Wachstum in Flüssigkultur Autoaggregate, die bei der
arcA-Deletionsmutante nicht mehr zu beobachteten waren. Darüberhinaus war die
Biofilmbildung der arcA-Deletionsmutante reduziert. Ein Tierversuch am Schwein ergab eine
geringere Virulenz der arcA-Deletionsmutante gegenüber dem Wildtyp. Klinische Symptome,
pathologische Lungenveränderungen und Reisolierbarkeit waren signifikant reduziert.
Um den Phänotyp von arcA- und hlyX-Deletionsmutante auf molekularer Ebene zu klären,
wurden beide Mutanten mit Hilfe von „microarrays“ und durch differentielle zwei-dimensionale
Gelelektrophorese (2D DIGE) untersucht. Die Aufklärung des ArcA-Regulons ergab, dass ArcA
93 Gene um mehr als 1,5-fach auf- und 106 Gene um mehr als 1,5-fach abreguliert; durch HlyX
wird die Expression von 398 Genen um mehr als 1,5-fach auf- und von 505 Genen
entsprechend abreguliert. Die Ergebnisse der Transkriptomanalyse wurden im Wesentlichen
durch die Proteomanalysen bestätigt. Die Auswertung der von ArcA regulierten Gene impliziert,
dass ArcA den Stoffwechsel auf Fumarat-Atmung unter anaeroben Bedingungen einstellt. In
einem begleitenden Projekt konnte diese Annahme inzwischen gestützt werden. Die Deletion
der Fumarat-Reduktase führte zu einer Attenuierung von A. pleuropneumoniae.
Ein Vergleich der „microarray“ Analysen ergab, dass ArcA und HlyX 64 Gene auf- und 39
Gene abregulierten. Eine gegensätzliche Regulation durch die beiden Transkriptionsfaktoren
wurde bei 11 Genen festgestellt. HlyX agierte als starker Positiv-Regulator von terminalen
Reduktasen, die DMSO, TMAO, Nitrat oder Nitrit verwenden. Während HlyX die Expression von
30 Genen um mehr als 7-fach aufregulierte, wurde für ArcA nur ein einziges Gen, das für eine
putative Methylierungsuntereinheit eines Restriktions-Modifikationssystems kodiert, gefunden,
dessen Expression so deutlich verstärkt wurde. Im Gegensatz dazu wurde kein Gen gefunden,
das durch HlyX um mehr als 7-fach abreguliert wurde, w&#