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Identification and characterization of protein phosphatase 4 regulatory subunit 1 (PP4R1) as a suppressor of NF-_k63B [NF-kappaB] in T-lymphocytes and T-cell lymphomas [Elektronische Ressource] / presented by Markus Brechmann

De
200 pages
Identification and Characterization of Protein Phosphatase 4 Regulatory Subunit 1 (PP4R1) as a Suppressor of NF- B in T Lymphocytes and T Cell Lymphomas DISSERTATION submitted to the Faculty of Biosciences of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany for the degree of Doctor rerum naturalium presented by Dipl. Biochem. Markus Brechmann born in Bielefeld, Germany thOral-examination: September 10 , 2010 Identification and Characterization of Protein Phosphatase 4 Regulatory Subunit 1 (PP4R1) as a Suppressor of NF- B in T Lymphocytes and T Cell Lymphomas Referees: PD Dr. Philipp Beckhove German Cancer Research Center, Heidelberg Prof. Dr. Peter H. Krammer German CaThis thesis is based on research conducted in the Division of Immunogenetics at the German Cancer Research Center (DKFZ), under supervision of Prof. Dr. Peter H. Krammer and direct supervision of PD Dr. Rüdiger Arnold in the period from October 2006 to June 2010. „Chance favours the prepared mind.“ OUIS PASTEUR L Danksagung Denen, die mich in den zurückliegenden dreieinhalb Jahren während meiner Doktorarbeit unterstützt und begleitet haben, möchte ich meinen großen Dank aussprechen. Zunächst möchte ich mich bei Prof. Dr. Peter H. Krammer für seine Unterstützung und stete Diskussionsbereitschaft bedanken.
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Identification and Characterization of
Protein Phosphatase 4
Regulatory Subunit 1 (PP4R1)
as a Suppressor of NF- B
in T Lymphocytes and T Cell Lymphomas



DISSERTATION

submitted to the
Faculty of Biosciences
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of Doctor rerum naturalium





presented by
Dipl. Biochem. Markus Brechmann
born in Bielefeld, Germany

thOral-examination: September 10 , 2010


Identification and Characterization of
Protein Phosphatase 4
Regulatory Subunit 1 (PP4R1)
as a Suppressor of NF- B
in T Lymphocytes and T Cell Lymphomas


















Referees: PD Dr. Philipp Beckhove
German Cancer Research Center, Heidelberg

Prof. Dr. Peter H. Krammer
German CaThis thesis is based on research conducted in the Division of Immunogenetics at the
German Cancer Research Center (DKFZ), under supervision of Prof. Dr. Peter H.
Krammer and direct supervision of PD Dr. Rüdiger Arnold in the period from October 2006
to June 2010.
































„Chance favours the prepared mind.“

OUIS PASTEUR L
Danksagung
Denen, die mich in den zurückliegenden dreieinhalb Jahren während meiner Doktorarbeit
unterstützt und begleitet haben, möchte ich meinen großen Dank aussprechen.

Zunächst möchte ich mich bei Prof. Dr. Peter H. Krammer für seine Unterstützung und
stete Diskussionsbereitschaft bedanken. Peter hat mir in seiner Abteilung nicht nur
exzellente Arbeitsbedingungen zur Verfügung gestellt. Insbesondere verkörpert er eine
Kultur sowohl (selbst)kritischer als auch auch kreativer Wissenschaft, welche mein
eigenes wissenschaftliches Denken maßgeblich geprägt hat und auch in Zukunft weiter
fortwirken wird.

Herrn PD Dr. Philipp Beckhove danke ich für die Betreuung dieser Arbeit als Erstgutachter.
Ferner möchte ich mich bei Prof. Dr. Felix Wieland, Prof. Dr. Martin Müller und Prof. Dr.
Carsten Watzl für die Betreuung meiner Promotion bedanken.

Insbesondere gilt ein großes DANKE PD Dr. Rüdiger Arnold, meinem direkten Mentor und
Betreuer. Seine Lebendigkeit, sein Optimismus und sein unbeirrter Glaube an mich haben
mir durch so manche Talsohle geholfen. Die ungezwungene und freundschaftliche
Zusammenarbeit mit Dir hat mir sehr viel Freude bereitet!

Darüber hinaus gilt mein großer Dank Thomas Mock, mit dem ich in den letzten zwei
Jahren nicht nur wissenschaftlich hervorragend zusammengearbeitet habe. Es ist nicht
selbstverständlich, derart vertrauensvoll und konstruktiv ein gemeinsames
wissenschaftliches Team zu bilden.

Auch möchte ich mich vor allem bei Dorothee Nickles wie auch Felice Frey für die sehr
fruchtbare und schöne Zusammenarbeit bedanken. Doro, Du hast einen sicherlich sehr
grundlegenden Anteil an dieser Arbeit! In diesem Zusammenhang danke ich auch Prof. Dr.
Michael Boutros für die exzellente Kooperation.

Ein großer Dank gilt vielen jetzigen und ehemaligen Mitgliedern der Abteilung
Immungenetik für Ihre Unterstützung in wissenschaftlichen Fragen, ihren Zuspruch und
natürlich für so manchen lebenswerten Moment jenseits der Laborbank! Insbesondere
danke ich Dirk Brenner, Julia Hoffmann, Michael Kiessling, Björn Linke, Mareike Becker, Danksagung

Wolfgang Müller und Marco Giasi, die mich durch diese sehr intensive Zeit begleitet
haben. Danke für die gemeinsame Zeit innerhalb und außerhalb des Labors!

Darüber hinaus danke ich Rüdiger Arnold, Thomas Mock, Michael Kiessling, Karsten
Gülow und Gernot Polier für das Korrekturlesen dieser Arbeit.

Daniel Dependahl und Boris Ullrich danke ich ganz besonders für unsere langjährige
Freundschaft.

Bei Eva-Maria Weiss bedanke ich mich für die sehr schöne Zeit auf der letzten Strecke
dieser Arbeit!

Bei meiner Schwester bedanke ich mich für ein jederzeit offenes Ohr und Deine
großartige Unterstützung in so manchen Lebensfragen während der zurückliegenden Zeit
in Heidelberg. Schön, dass es Schwestern wie Dich gibt!

Der größte Dank gilt meinen Eltern, die mich jederzeit bedingungslos unterstützt haben.
Ich danke Euch aus ganzem Herzen für Euer Verständnis, Euer Interesse und Eure
Rücksichtnahme. Ohne Euch wäre das alles nicht möglich gewesen. Ihr bedeutet mir viel.
I
Summary
The transcription factor nuclear factor-kappaB (NF- B) plays a key role in the immune
system by controlling lymphocyte survival and activation. Conversely, aberrant NF- B
activity has been implicated in several lymphoid malignancies and contributes to a variety
of autoimmune disorders.
While multiple kinases and phosphorylated target proteins that induce NF- B activity have
been identified, the molecular machinery involved in the termination of antigen receptor-
mediated NF- B activation is only partially understood. Since signal transduction from
activated receptors to NF- B largely relies on phosphorylation events, phosphatases are
expected to play a major role in the modulation and termination of NF- B activity.
Therefore, the current study aimed at systematically defining phosphatases that are
involved in T cell receptor (TCR)-induced NF- B signaling. To this end, an RNA
interference (RNAi) genetic screen has been adopted based on a novel NF- B-dependent
reporter system. Using this approach, several NF-B-modulating phosphatases were
identified among which the protein phosphatase 4 regulatory subunit 1 (PP4R1) was
confirmed as a central negative regulator of NF- B activity in T lymphocytes. PP4R1
expression is strongly upregulated in primary human T lymphocytes upon activation.
PP4R1 specifically binds to the inhibitor of NF- B kinase  (IKK ) and the catalytic
subunit PP4c, thereby directing PP4c phosphatase activity to dephosphorylate and
inactivate the IKK complex. Accordingly, PP4R1 silencing causes sustained and
increased IKK activity and T cell hyperactivation as reflected by enhanced induction of
NF- B target genes and secretion of cytokines. Conversely, PP4R1 overexpression
significantly impairs NF- B activation upon TCR stimulation, but does not affect AP-1
signaling. Furthermore, PP4R1 was found to be downregulated in a subset of malignant T
lymphocytes derived from patients with Sézary syndrome, a severe form of cutaneous T
cell lymphoma (CTCL). PP4R1 deficiency causes constitutive IKK/NF- B signaling and is
required for survival of NF- B-addicted CTCL cells.
In summary, the present work identified PP4R1 as a central gatekeeper of IKK activity and
as a suppressor of T cell activation and lymphoma survival. These findings expand our
current knowledge of NF- B signal transduction and contribute to a more precise
molecular understanding of NF- B regulation in health and disease.
II
Zusammenfassung
Der Transkriptionsfaktor nuclear factor-kappaB (NF- B) nimmt eine zentrale Stellung im
Immunsystem ein. Physiologische NF- B Aktivität ist essentiell für das Überleben und die
Aktivierung von Lymphozyten. Hingegen ist aberrante NF- B Signalgebung mit
verschiedenen hämatologischen Neoplasien und Autoimmunerkrankungen assoziiert.
Die T Zell-Rezeptor (TZR)-induzierte NF- B Signalkaskade involviert eine Vielzahl von
Kinasen und phosphorylierter Effektormoleküle. Im Gegensatz hierzu sind die
molekularen Mechanismen, die der negativen Regulation des NF- B Signalweges
zugrunde liegen, nur zum Teil verstanden. Da Phosphorylierungsreaktionen ein zentrales
Merkmal der Rezeptor-induzierten NF- B Aktivierung darstellen, werden Phosphatasen
als wichtige Modulatoren von NF- B Aktivität vermutet.
Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Funktion einzelner Phosphatasen im TZR-
induzierten NF- B Signalweg systematisch zu adressieren. Hierfür wurde ein RNA
Interferenz (RNAi) Screen durchgeführt auf Grundlage eines neu entwickelten NF- B-
spezifischen Reporter-Systems. Unter verschiedenen NF- B-modulierenden Phospha-
tasen wurde die protein phosphatase 4 regulatory subunit 1 (PP4R1) als ein zentraler
negativer Regulator der NF- B Aktivierung in T Lymphozyten identifiziert. Die PP4R1
Expression wird in aktivierten humanen T Lymphozyten stark induziert. PP4R1 fungiert als
ein Adapter zwischen der inhibitor of NF- B kinase  (IKK ) und der katalytischen PP4
Untereinheit PP4c und reguliert somit PP4 Phosphatase Aktivität zur spezifischen
Dephosphorylierung und Inaktivierung des IKK Komplexes. Die RNAi-vermittelte
Suppression der PP4R1 Expression verursacht eine erhöhte und prolongierte IKK Aktivität
und eine verstärkte Induktion und Sekretion NF- B-abhängiger Gene bzw. Zytokine.
Umgekehrt führt die Überexpression von PP4R1 zu einer spezifischen Blockade des
NF- B Signalweges nach TZR Stimulation. In malignen T Lymphozyten von Patienten mit
dem Sézary Syndrom, einer aggressiven und leukemischen Variante des Kutanen T Zell
Lymphoms (engl.: cutaneous T cell lymphoma, CTCL) ist die PP4R1 Expression deutlich
erniedrigt. Die Defizienz von PP4R1 resultiert in konstitutiver IKK/NF- B Signalgebung
und ist verantwortlich für das Überleben NF- B-abhängiger CTCL-Zellen.
In dieser Arbeit konnte PP4R1 als ein neuer zentraler Regulator des NF- B Signalweges
und als ein Suppressor von T Zell-Aktivierung und T Zell-Lymphomen identifiziert werden.
Dies erweitert unser molekulares Verständnis des NF- B Signalweges und seiner
Regulation unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen. III
Table of contents

Summary .............................................................................................. I 

Zusammenfassung ............................................................................. II 

Table of contents ............................................................................... III 

1  Introduction ................................................................................... 1 

1.1  The immune system .................................................................................. 1 
1.1.1  Innate immunity ............................................................................................ 1 
1.1.2  Adaptive immunity ........................................................................................ 2 
1.1.3  Cross talk between innate and adaptive immunity:
initiation of an acquired immune response ................................................... 3 

1.2  Signal transduction from the T cell antigen receptor (TCR) .................. 4 
1.2.1  Structure and composition of the TCR ......................................................... 4 
1.2.2  Assembly and activation of the TCR proximal signalosome ......................... 5 
1.2.3  Activation of PLC 1....................................................................................... 7 
2+1.2.4  TCR-induced Ca signaling ......................................................................... 8 
1.2.5  Activation of DAG-dependent pathways ....................................................... 9 
1.2.6  TCR-induced JNK and p38 activation ........................................................ 10 
(i)  TCR-induced JNK activation ...................................................................... 10 
(ii)  TCR-induced p38 activation ....................................................................... 11 

1.3  Signaling to NF- B ................................................................................... 11 
1.3.1  The NF- B core signaling machinery ......................................................... 12 
(i)  B family of transcription factors ................................................... 12 
(ii)  The I B family ............................................................................................ 13 
(iii)  The I B kinase complex ............................................................................. 13 
1.3.2  Activation of IKK: the canonical and non-canonical NF- B signaling
pathway ...................................................................................................... 16 
(i)  The canonical NF- B pathway ................................................................... 18 
(ii)  The non-canonical pathway ....................................................................... 18 
1.3.3  Mechanisms and principles of IKK activation ............................................. 19 
1.3.4  TNFR-induced NF- B activation ................................................................. 21 
1.3.5  TCR-induced NF- B activation ................................................................... 22 

1.4  Mechanisms of negative regulation and signal termination ................ 25 
1.4.1  The human phosphatasome and its expression in T cells .......................... 25 
1.4.2  Negative regulation of proximal TCR signaling by phosphatases .............. 26 
1.4.3  The NF- B-regulating phosphatasome ...................................................... 27 
1.4.4  Non-phosphatase-based negative regulation of canonical NF- B ............. 29 

1.5  NF- B and lymphoid malignancies ........................................................ 30 
1.5.1  Target genes of NF- B and their implications in tumorigenesis ................. 30 Table of contents IV
1.5.2  Mutations associated with constitutive NF- B activity ................................ 32 
1.5.3  The Sézary syndrome and its link to NF- B ............................................... 35 

2  Aims of the study ....................................................................... 37 

3  Materials ..................................................................................... 38 

3.1  Chemicals, reagents, and kits ................................................................ 38 
3.1.1  Chemicals ................................................................................................... 38 
3.1.2  Consumables .............................................................................................. 38 
3.1.3  Commercial kits and reagents .................................................................... 39 
3.1.4  Reagents and kits for isolation of T cells .................................................... 40 
3.1.5  Reagents for treatment of cells ................................................................... 40 

3.2  Buffers and solutions .............................................................................. 41 

3.3  Culture media ........................................................................................... 43 
3.2.1  Media for bacteria ....................................................................................... 43 
3.3.2  Media and supplements for eukaryotic cell culture ..................................... 44 

3.4  Biological material ................................................................................... 44 
3.3.1  Bacteria ...................................................................................................... 44 
3.3.2  Mammalian cell lines .................................................................................. 45 

3.5  Materials for molecular biology .............................................................. 46 
3.5.1  Phosphatase siRNA library ......................................................................... 46 
3.5.2  siRNA sequences 46 
3.5.3  shRNA sequences ...................................................................................... 47 
3.5.4  PCR primers for gene cloning .................................................................... 47 
3.4.5  qRT-PCR primers ....................................................................................... 48 
(i)  SYBR Green qRT-PCR primer pairs .......................................................... 49 
(ii)  Primer pairs for UPL assays ...................................................................... 50 
3.4.6  Enzymes ..................................................................................................... 50 
3.4.7  Vectors ....................................................................................................... 51 

3.5  Antibodies ................................................................................................ 53 
3.5.1  Antibodies for immunoblotting (IB) and immunoprecipitation (IP) .............. 53 
(i)  Primary antibodies for IB and antibodies for IP .......................................... 53 
(ii)  Conjugated antibodies for IB and flow cytometry ....................................... 54 
3.5.2  Antibodies for T cell stimulation .................................................................. 55 

3.6  Instruments .............................................................................................. 55 

3.7  Software .................................................................................................... 57