Improved in vitro bone-like tissue formation by human trabecular bone cells in a novel three dimensional cultivation system [Elektronische Ressource] / von Nadia Zghoul

Nadia Zghoul

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• Gesundheit

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 43
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

Improved in vitro bone-like tissue formation
by human trabecular bone cells in a novel
three dimensional cultivation system








Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover




zur Erlangung des Grades
DOKTORIN DER NATURWISSENSCHAFTEN
Dr. rer. nat.



genehmigte Dissertation
von






Apothekerin Nadia Zghoul
geboren am 21. August 1975, in Meppen




2007














Referent : Prof. Dr. Thomas Scheper
Institut für Technische Chemie
Universität Hannover

Korreferent : Prof. Dr. Martijn van Griensven
Ludwig Boltzmann Institut
für experimentelle und klinische Traumatologie
Wien

Tag der Promotion : 14. September 2007












Erklärung

Ich versichere, dass ich diese Dissertation selbstständig und nur unter Verwendung der
angegebenen Hilfsmittel und Quellen durchgeführt habe.
Diese Arbeit wurde nicht als Diplomarbeit oder ähnliche Prüfungsarbeit verwendet.



Hannover, im Juni 2007
Zusammenfassung


Zusammenfassung

Die in vitro Rekonstruktion von dreidimensionalem knochenartigen Gewebe
erfordert die Verfügbarkeit einer ausreichenden Menge von Zellen, ein
geeignetes Trägergerüst zur Zellbesiedlung, sowie eine geeignete
Kultivierungsmethode, die eine homogene Zellverteilung und Gewebeneu-
bildung in der gesamten Gerüststruktur ermöglicht. Zielsetzung dieser
Dissertation war die Untersuchung von trabekulären Knochenzellen auf deren
Eignung zur Geweberekonstruktion von Knochen, sowie die Entwicklung eines
Herstellungsverfahrens zur Produktion von implantierfähigem menschlichen
Knochengewebe in vitro. Hierzu wurde zunächst die Isolierung, Kultivierung
und Expansion humaner trabekulärer Knochenzellen etabliert. Die Zellen
wurden im größeren Maßstab in Wannenstapel erfolgreich expandiert und der
mesenchymale Stammzellcharakter dieser Zellen durch ihr adipogenes,
chondrogenes und osteogenes Potenzial verifiziert. Ein geeignetes
Trägergerüst aus Poly-(lactid-glycolid)-Copolymer und Kalziumphosphat
wurde mit den trabekulären Knochenzellen besiedelt. Die Kultivierungs-
verfahren unter statischen und dynamischen Bedingungen wurden
miteinander verglichen. Die dynamische Kultivierung erfolgte in einem
neuentwickelten Rotationskultivierungssystem, dass eine wipp- und
rotationsartige Bewegung kombiniert und in einem Perfusionsbioreaktor.
Unter Verwendung des Rotationskultivierungssystems, konnte im Vergleich
zu den bislang bekannten Kultivierungstechniken, eine ausreichende Medium-
und Sauerstoffversorgung, eine deutlich bessere Zellverteilung und eine
deutlich bessere neu gebildete extrazelluläre Matrixverteilung im Inneren des
Gerüsts erreicht werden. Histologische Untersuchungen, sowie unterstützende
biochemische Analytik bestätigen eine de novo Knochenbildung. Die Qualität
der Neubildung wurde durch die wipp- und rotationsartige Bewegung stark
verbessert. Hinsichtlich einer klinischen Anwendung des kultivierten Zell-
Gerüst-Konstrukts zur Regeneration von Knochendefekten in vivo, ist dieser
Kultvierungsansatz sehr vielversprechend.

Schlagwörter : Mesenchymale Stammzellen, Osteogenese, Geweberekonstruktion.
- I - Abstract


Abstract

This dissertation set out to address the goal of optimizing and developing three
dimensional cultivation conditions by exposing human mesenchymal-like stem
cells in conjunction with a porous scaffold, to the correct mechanical and
biochemical stimulus in an optimal microenvironment to improve current
protocols and strategies in bone tissue engineering. Trabecular bone was
demonstrated to be a good and readily available source of mesenchymal
progenitor cells. A high yield isolation procedure was established from small
bone tissue biopsies and the isolated cells were successfully expanded
reproducibly on a large scale in cell factories. Their multilineage
differentiation potential, displaying the ability to differentiate into the
adipogenic, chondrogenic and osteoblastic lineage was also successfully
demonstrated. For three dimensional bone-like tissue formation in vitro, these
cells were cultivated in conjunction with a Poly-(lactic-co-glycolide)/calcium
phosphate scaffold statically, as well as dynamically in a fixed bed perfusion
bioreactor and in a novel tilted rotating system. Despite improved nutrient
delivery in both dynamic systems, ubiquitous cell and newly deposited
extracellular matrix distribution throughout the whole scaffold structure was
observed to occur when cultivated in the tilted rotating bioreactor system.
Improved osteogenesis through the tilted rotating movement was supported by
in depth histological analysis and biochemical analysis of bone-specific
markers. The viable reconstructed cell-scaffold construct generated in vitro in
the tilted rotating system showed high resemblance to native bone tissue in
terms of osteocytic cell shape held within the extracellular matrix, interacting
with each other through specific bone gap junctional proteins with a very high
chance of being integrated in vivo representing a promising tool for bone defect
regeneration.

Keywords: Mesenchymal stem cells, osteogenesis, tissue engineering.
- II - Table of Contents



Table of Contents


1. General Introduction……………………………………………… 1
1.1. Overview and State of Research…………………………………….. 1
1.1.1. The Bone and Joint Decade: 2000-2010……………………………………… 1
1.1.2. Tissue Engineering of Bone……………………………………………………… 3
1.1.3. Basic Bone Biology and Natural Formation Bone……… 4
1.1.4. In vivo Bone Formation …………………………………… 11
1.1.5. In vitro Bone Formation……………………………………………… 13
1.1.6. Bone Tissue Engineering Strategy for the Generation of an in vitro Bone
Construct………………………………………………………………….. 15
1.2. Rationale of the Study…………………………………………………………………… 20
1.3. Goals of the study…………………………………………………………………………… 21

2. Isolation, Expansion and Characterization of Human Adult
Tissue Derived mesenchymal-like Cells for Bone Tissue 23
Engineering Purposes
2.1. Introduction………………………………………………………………………………… 23
2.2. Materials and Methods………………………… 24
2.2.1. Human Bone Marrow Derived Cells…………………………………………… 24
2.2.2. Human Trabecular Bone Derived Cells………………… 25
2.2.3. Cell Viability: WST-1…………………………………………………………… 26
2.2.4. Total Protein Assay: Bicinchoninic Assay-Micro BCA™………… 26
® 2.2.5. Cell Proliferation: DNA Determination with CyQUANT………………… 27
2.2.6. Human Serum…………………………………………………………………… 27
2.2.7. Large Scale Cell Expansion……………………… 30
2.2.8. Glucose and Lactate Analysis…………………………………………………… 33
2.2.9. Multilineage Potential of Human Trabecular Bone Derived Cells……… 34
2.2.10. Alkaline Phosphatase Activity Assay………………………………………… 35
2.2.11. Collagen Type I Assay………………………………………. 37
2.2.12. Calcein for Mineralization…………………………………………… 37
2.2.13. Histochemical Analysis……………………………………………….. 38
2.3. Results and Discussion…………………………………………………………………... 41
2.3.1. Cell Isolation and Culture of Human Mesenchymal-like Cells…………… 41
2.3.2. Medium Optimization………………………………………………… 45
2.3.3. Cell Expansion and Differentiation Media………………………… 52
2.3.4. Large Scale Cell Expansion…………………………………………… 55
2.3.5. Cell Characterization……………………………………… 58
2.2.6. Osteogenic Differentiation of Trabecular Bone Derived Cells vs. Human
Bone Marrow Derived Cells............................................................................ 60
2.4. Conclusions………………………………………………………………………………….. 71

3. Improved in vitro Bone-like Tissue Formation by Trabecular
73 Bone Derived Cells in Three Dimensional Culture
3.1. Introduction………………………………………………………………………………… 73
3.2. Materials and Methods………………………… 75
3.2.1. Poly (lactide-co-glycolide)-Calcium Phosphate Composite Scaffold……… 75
3.2.2. Scaffold Sterilization……………………………………………………………… 75
3.2.3. Scaffold Surface Coating……………………………………. 76
3.2.4. Scaffold Seeding or Cell Culture on Scaffolds………………………………… 76
3.2.5. Three Dimensional Cultivati