Investigation of endosomal recycling of synaptic vesicles [Elektronische Ressource] / submitted by Peer Hoopmann

Phoopma

Sujets

• Naturwissenschaften

Informations

• Publié par: georg-august-universitat_gottingen
• Publié le: 01 janvier 2010
• Nombre de lectures: 34
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 13 Mo

Extrait

 
INVESTIGATION OF ENDOSOMAL RECYCLING 
OF SYNAPTIC VESICLES 
 
 
 
Dissertation 
 
in partial fulfilmlent of the requirements for the de gree
“Doctor of Natural Sciences (Dr. rer. nat. )”
in the Molecular Biology Program a t the
Georg August University Göttingen,l tFya cou f Biolo gy
 
 
 
 
submitted by 
Peer Hoopmann 
 
 
born i n
Thedinghausen, German  y
 
 
 
 
 
 
 
September 2010  

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
I hereby declare that I prepareddi stsehret ation enti t“lIednvestigation of Endosomal 
Recycling of Synaptic Vesicl eos”n my own and with no other sources and aids than 
quoted.   
 
 
Peer Hoopman n
LIST OF PUBLICATIONS 
Hoopmann  P, Punge  A,  Barysch  SV,  Westphal  V,  Bückers OJp,a zo  F,  Bethani  I, 
Lauterbach MA, Hell SW, Rizzo.l iE SnOdosomal sorting roefa dliy releasable synaptic 
vesicles. Proc Natl Acad Sci U S Ain. press 
 
Hoopmann P, Rizzoli SO, Betz. I WmJaging synaptic vesicle dynamics with FM ydes. 
Optical Imaging in Neuroiescnce (Book chapter)i.n  press 
 
Opazo F, Punge A,ck Büers J,H  oopmann P, Kastrup L, Hell SW, Rizzoli SO (2010) 
Limited Intermixing of Synaptic Vesicle Components upon Vesicle Recycling. Traffic 
11:800‐812. 
 
Geumann U, Barysch SV,Ho  opmann P, Jahn R, Rizzoli SO (2008) SNARE function is not 
involved in early ednosome docking. Mol Biol Cell 19:53‐25337.7  
I 
TABLE OF  CONTENTS  
List of Publications________________________________ ___________________________ I 
Table of Contents II 
Acknowledgements ________________________________ _________________________ IV 
Abstract ________________________________ ________________________________ __ V 
List of Figures ______________________________ VI 
List of Tables________________________________ VI I
List of Abbreviations ________________________________ ______________________ VII I
1.  Introduction __________________________ 10 
1.1  Pre‐Synaptic Functio________________________________n ________________________________ _10 
1.2  Endosomal Trafficking _20 
1.3  Endosomes and Synaptic Vesicles ____________________ 26 
1.4  Aim of the Project ______ 31 
2.  Materials and Methods _________________ 32 
2.1  Antibodie________________________________s ________________________________ ______________ 32 
2.2  Chemicals and Reagents _______________________________ 34 
2.3  Microscopy _____________ 35 
2.4  Neuronal Cell Culture __38 
2.5  Preparation of Lumenally Labeled Synaptic Vesicles 38 
2.6  PHluorin Expression and Imagi________________________________ng ____________________ 40 
2.7  Phot‐oxidation Electron Microscopy ________________ 43 
2.8  Quantum Dot Imaging and Analysis __________________ 45 
2.9  Rab5‐GFP Expression and Imaging ___________________ 46 
2.10  Blocking Endosome Function with Soluble Syntaxin 13 Frag_______________ment 49 
2.11  SynaptiVc esicle Marker Surface Immunostainin________________________________g _51 
2.12  Isolated Synaptic Vesicle Immunoassay ____________ 52 
2.13  Extraction of Cholesterol from Endosomes _________ 54 
3.  Results________________________________ _______________________________ 55 
3.1  Endosomal SNAREs Participate in Synaptic Vesicle Recyc_____________________ling 55 
3.2  Morphological Evidence for Endosomal Fusion of RRP Ve___________________sicles 59 
II  3.3  Endocytosed Vesicle Protein ReacBhoinag F  ide Endosomes_____________________ 65 
3.4  Effects of Inhibiting Endosomal Func________________________________tion ____________ 70 
3.5  The Recycling‐Step Necessitating Endosomal Sor______________________________ting 75 
3.6  How Can Endosomes Sort Synaptic Vesicle Comnpeonts?__________________________ 83 
4.  Discussion ________________________________ ____________________________ 84 
4. 1 Exchange of Molecules during Vesicle Recycling ____84 
4. 2 Mechanisms of Endosomal Sorting of Synaptic Ve____________________________sicles 87 
4. 3 Synaptic Vesicle Pools and Endosomal Recycl________________________________ing ___89 
4. 4 Perspectives for Synaptic Vesicle Recycling _________ 90 
5.  Summary and Conclusions________________________________ _______________ 93 
5.1  Do  Endosomal  Proteins  CycBle tween  Internal  Organelles  and  the  Plasma 
Membrane upon Stimulation? _______________________________ 94 
5.2  Do Synaptic Vesicles Fuse with Endosomes During Recyclin____________________g? 95 
5.3  Does Inhibition of Endosomal Function Have an Ef fAecnty  oonf the Synaptic 
Vesicle Pools?________________________________ ________________________________ _________________ 95 
5.4  Do Vesicle and Plasma Membrane Components Intermix during Synaptic Vesicle 
Recycling? _____________________ 96 
5.5  How Could Endosomal Sorting Maintain Synaptic Vesicle I?d_______________entity 96 
5.6  Open Questions _________ 97 
Bibliography ________________________________ ______________________________ 99 
A.  Appendix ___________________________ 109 
1.  Matlab Routines for pHluorin Analy________________________________sis _______________ 109 
2.  Matlab Routines foirn vitro Immunoassay Analysis _116 
Curriculum Vitae ________________________________ _________________________ 150 
 
III 
ACKNOWLEDGEMENTS  
First and foremost I watont t hank my supervisor Dr.S  ilvio Rizzoli form neroetly  being 
a supervisor – you are a true mento. Trhank you for teaching me how to “dsmoar  t 
science” and how to be criticTahla.n  k you for yuor endless support, patience and adv. ice
Thank you fort he time you spared for all those instances of “jusmti na ute” and “can I 
ask you something ”and thank you for sharing your thoughts and Ij oamk esd.e eply 
indebted to y oanud I truly hope you will give me a chance to re tthuer nfavor.  
   
I want to thaPnrk ofessor Reinhard Jahn and Professor Nils Broseb efoinrg  on 
my PhD committee. Thank you forsh aringy our scientifice  xperiencea nd for giving 
helpful and critical advic e.
 
  I want to thank all the collaborwahtoo aris ded in performin gexperiments