Irradiations localisées pour des greffages convalents sur supports, Localized irradiations for covalent graftings on glass substrates

Fanny Evenou

Description

Sous la direction de Marie-Christiane Carre
Thèse soutenue le 23 octobre 2006: INPL
L'étude porte sur la réalisation d'un support plan fonctionnalisé et structuré pour l’immobilisation d’un nombre limité de biomolécules sondes telles que des carbohydrates, des protéines, des anticorps. Les supports sont des lames commerciales silanisées avec un amino-silane sur les deux faces. Des composés fluorescents porteurs de fonctions aldéhyde ou acide ont été utilisés comme modèles pour valider les greffages covalents sur ces supports via une liaison imine ou amide respectivement. Pour localiser les greffages, des puits en polymère de géométrie contrôlée à base de résine SU-8 ont été directement fabriqués sur la surface par un procédé de stéréolithographie. Le greffage de deux fluorophores acides a été réalisé simultanément dans différents puits sur un même support. La localisation des réactions a été caractérisée par spectroscopie et/ou microscopie de fluorescence. Pour permettre la fixation de composés porteurs d’une ou plusieurs fonctions aldéhyde, tels que des anticorps après oxydation des carbohydrates présents sur leur fragment Fc, un bras espaceur de type polyoxyéthylène terminé par une fonction aminooxy ou hydrazide a été synthétisé directement sur la surface des supports.
-Support plan silanisé
-Fluorophores
-Greffages covalents
-Spectrofluorimétrie
-Microscopie de fluorescence
-Stéréolithographie
-Microfabrication
-Polymère
This work deals with manufacturing functionalized and patterned plane substrates to immobilize a few biological components like carbohydrates, proteins or antibodies. The substrates are commercial glass microscope slides silanized with an amino linker on the two sides. Covalent binding on such substrates has been successfully tested using fluorophores as models with carboxylic acid or aldehydic function to afford respectively amide or imine bond with the amino functions of the support. To localize chemical graftings, polymeric regular and geometrically controlled wells were manufactured from SU-8 photoresist directly on the glass support, applying stereolithography process. Grafting of two fluorophores with carboxylic functions activated by N-hydroxysuccinimide was led simultaneously inside polymeric wells on a same substrate. Localized bindings were characterized by fluorescence spectroscopy and/or microscopy. In order to enable covalent attachment through a stable chemical linkage of aldehydic components, like antibodies after oxidation of their Fc fragment, aminooxy and hydrazide terminated polyoxyethylene spacers were directly synthesized on substrates surface
Source: http://www.theses.fr/2006INPL057N/document

Sujets

• Fluorochrome
• Spectroscopie de fluorescence
• Microscopie à fluorescence
• Stéréolithographie
• Polymère

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 116
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 6 Mo

Extrait

INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
ECOLE NATIONALE SUPERIEURE DES INDUSTRIES CHIMIQUES

Département de Chimie Physique des Réactions, UMR 7630 CNRS-INPL




THESE

pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Discipline : Génie des Procédés

Ecole Doctorale Science et Ingénierie des Ressources, Procédés, Produits, Environnement

présentée et soutenue publiquement

par

Fanny EVENOU

le 23 octobre 2006




Irradiations localisées pour des greffages covalents sur supports








JURY


Rapporteurs Valery G. BABAK
Philippe GEOFFROY
Examinateurs Nadine MARTINET
André MERLIN
Marie-Christiane CARRE
Serge CORBEL
Invités Mireille DONNER
Francis BAROS

Remerciements


Le travail présenté dans ce mémoire a été effectué à l’Ecole Nationale Supérieure des
Industries Chimiques (ENSIC) de Nancy, au sein du Département de Chimie-Physique des
Réactions (DCPR), UMR 7630 CNRS-INPL.

Je tiens tout d’abord à remercier les Directeurs du DCPR pour m’avoir accueillie au sein de
leur laboratoire : Madame Marie-Laure Viriot, DR CNRS tout d’abord, ainsi que Monsieur
Gabriel Wild, DR CNRS qui lui a succédé dans ses fonctions.

Je remercie ensuite chaleureusement Madame Marie-Christiane Carré, CR INSERM,
Messieurs Serge Corbel et Francis Baros, CR CNRS pour m’avoir encadrée au cours de ces
trois années et m’avoir fait partager leurs connaissances et compétences aussi bien sur le plan
théorique qu’expérimental.

Je tiens à exprimer ma reconnaissance à Messieurs Valery Babak, Professeur à l’Académie
des Sciences de Moscou, Philippe Geoffroy, CR CNRS à l’Université de Strasbourg et André
Merlin, Professeur à l’Université Henri Poincaré de Nancy, pour avoir accepté de juger ce
travail.

Je remercie Madame Nadine Martinet, DR INSERM pour son implication dans mon sujet de
recherche, sa motivation et pour l’aide qu’elle m’a apportée pour que je puisse mener à bien
mes travaux.

Je remercie Madame Mireille Donner, DR INSERM pour l’intérêt qu’elle a manifesté vis-à-
vis de ce travail ainsi que pour sa disponibilité et son aide.

Je remercie Hervé Le Gall pour son aide et sa compétence.

Je remercie aussi tout particulièrement Christian Receveur pour sa gentillesse, son aide
précieuse, sa disponibilité et ses explications passionnées.

Je remercie à leur tour pour leur gentillesse, leur humanité ou encore l’aide qu’il ont bien
voulu et su m’apporter : Nathalie Petijean, Denise Hagnier, Alain Paternotte, Pierre Pommier,
Lucie Coniglio-Jaubert, Céline Frochot et Orfan Zahraa.

Je tiens à remercier (dans l’ordre de présentation dans le bureau du point de vue de ma
chaise) : Guillaume, mon nouveau collègue d’en face, pour sa sympathie, pour sa
connaissance de la langue anglaise digne d’un dictionnaire Harraps, pour m’avoir récupéré ma
table de cuisine, et à qui je souhaite bonne chance pour la suite ; Momo ou
Mohhhhhhhhhhhamed pour sa sympathie, pour les pauses passées ensemble, et pour son
adhésion à mon humour ; Freufreu, pour la complicité qu’il y a pu avoir entre nous à la grande
époque, pour son humour et les pauses, pour les thésards, pour l’enquête à propos du … du
matin, pour les repas-thésards, pour up’cming’split (que je n’oublierai pas de prendre dans
mes bagages !), et pour le Lux’ ; Tylvain Suchard, pour sa grande connaissance de la langue
latine, ses ‘blagues’, sa modestie, ses chemises roses ; Emir, pour le souvenir de mon appart à
Nancy ; le mec (qui risque déjà d’être vexé d’être à cette position dans mes remerciements,
mais j’ai déjà expliqué pourquoi !), pour sa gentillesse et sa grande générosité sans nulle autre
pareille, sa maturité, ses citations/métaphores/anecdotes éclairées, pour m’avoir appris l’arabe
(un petit peu), pour sa bonne humeur, pour les bourraks et je m’arrête là avant que les
chevilles gonflent trop malgré sa très grande modestie ; Matthieu, que je regrette de ne pas
avoir davantage connu ; Nono pour son sourire ; Hichem, pour sa gentillesse ; Jean-Phi, pour
sa sympathie et pour avoir égayé le labo de chimie cette dernière année ; Christophe, pour le
post-doc et sa disponibilité au grand jeu ‘question pour un champion’.

Mes remerciements les plus sincères à mes zamis qui m’ont rendu la vie à Nancy
particulièrement agréable et pour longtemps j’espère encore : Fred-Bidouille, Gaby, Antoine,
Alex, Jalil, Beber, Smurss.

Je remercie enfin, mais non pas le moins, Zouzou, qui va énormément me manquer, pour le
soleil qu’il a fait entrer dans ma vie, pour son amour constant et sans faille, et quoiqu’en
disent les mauvaises langues, parfaitement désintéressé.


SOMMAIRE GÉNÉRAL


A. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ...................................................................... 5
A.I. Les biopuces .............................................................................................. 9
A.II. Stratégies d’immobilisation des sondes sur différents types de
supports...........................................................................................................19
A.III. Localisation des greffages sur les supports.......................................32
A.IV. Détection des interactions sonde/cible ...............................................37
A.V. Objectifs et organisation de la thèse....................................................43
B. GREFFAGES COVALENTS SUR SUPPORTS PLANS............................45
B.I. Choix du support ....................................................................................49
B.II. Les techniques et systèmes d’analyse utilisés .....................................52
B.III. Caractérisation des supports commerciaux......................................55
B.IV. Greffage covalent de traceurs fluorescents sur les lames
commerciales ..................................................................................................67
B.V. Partie expérimentale .............................................................................73
B.VI. Conclusion sur les greffages sur supports.........................................79
C. LOCALISATION DES SITES RÉACTIONNELS ......................................81
C.I. Mise en oeuvre de la stéréolithographie...............................................85
C.II. Méthode de localisation des sites.........................................................92
C.III. La résine de photopolymérisation : la SU-8 5...................................95
C.IV. Fabrication des motifs en polymère...................................................99
C.V. Analyse par profilométrie optique ....................................................108
C.VI. Résultats des analyses réalisées avec le profilomètre optique.......110
C.VII. Stabilité du polymère dans différents solvants .............................132
D. LOCALISATION DES GREFFAGES COVALENTS ..............................135
D.I. Localisation des greffages....................................................................139
D.II. Puits en polymère................................................................................150
D.III. Plots en polymère ..............................................................................165
D.IV. Conclusion ..........................................................................................171
E. PRÉPARATION DES SUPPORTS EN VUE DU GREFFAGE ORIENTÉ
D'ANTICORPS.................................................................................................173
E.I. Préparation des supports fonctionnalisés...........................................177
E.II. Greffage du bras espaceur diamino sur les lames S ........................181
E.III. Fonctionnalisation du bras espaceur ...............................................188
E.IV. Partie expérimentale..........................................................................195
E.V. Conclusion............................................................................................203
TABLE DES MATIÈRES


A. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ...................................................................... 5
A.I. Les biopuces .............................................................................................. 9
A.I.1. Les puces à ADN ................................................................................................... 10
A.I.1.1. Rappels sur l’ADN..................