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La spectrométrie de masse appliquée à la quantification des protéines médicaments dans le plasma

De
258 pages
Sous la direction de Dominique Breilh, Jean-Marie Schmitter
Thèse soutenue le 01 décembre 2008: Bordeaux 1
Le nombre croissant de médicaments protéiques utilisés en thérapeutique a créé des besoins dans le domaine de leur quantification, principalement dans le plasma, un milieu de composition protéique complexe. Le dosage, essentiel aux études pharmacocinétique/pharmacodynamique, ainsi qu’à l’optimisation de ces traitements, est compliqué par la nature protéique de ces médicaments et par les faibles concentrations auxquelles ils sont attendus dans ces milieux complexes. La méthodologie proposée se démarque des méthodes de dosage usuelles par son caractère universel. Elle fait appel à la spectrométrie de masse adaptée à la quantification des protéines grâce à l’utilisation d’un marquage isotopique différentiel des peptides : après enrichissement et protéolyse, l’échantillon à doser est marqué sur les lysines par la version légère d’un réactif de dérivation. En parallèle, les peptides de la protéine médicament pure marqués par la version lourde du réactif, servent d’étalon interne. La possibilité de quantifier la protéine à partir de plusieurs de ses peptides améliore la fiabilité du dosage. Appliquée à l’epoetin beta aux concentrations attendues en thérapeutique (autour de 0,5 femtomole/µL de plasma), la stratégie proposée permet de situer la limite de quantification à environ 50 attomoles d’epoetin beta/µL de plasma avec une méthodologie de spectrométrie de masse nano-LC-ESI-Q-TRAP fonctionnant en mode MRM. Pour étendre l’universalité de cette approche au champ des protéines médicaments pégylées, une seconde molécule a été étudiée. Il s’agit de l’interféron alfa-2b pégylé qui a permis de mettre en place une stratégie d’extraction spécifique du médicament utilisant sa pégylation.
-protéines médicaments
-spectrométrie de masse
-Multiple Reaction Monitoring (MRM)
-marquage chimique isotopique
-quantification
-protéines pégylées
The growing number of therapeutic proteins has created needs in the field of their quantification, mainly in plasma, which is a complex protein environment. Quantitative analysis of these proteins is essential for pharmacokinetics/pharmacodynamics studies, and for the optimization of treatments. However, the nature itself of the analyte and the low concentrations that are expected in plasma complicate the quantitative analysis. The proposed methodology differs from usual methods on its universal applicability. It relies on mass spectrometry adapted to the quantification of proteins by using peptides differential isotope labelling : after enrichment and proteolysis, the therapeutic protein and the plasmatic proteins are labelled on lysine residues by the light reagent. In parallel, peptides of the pure therapeutic protein, labelled by heavy version of reagent, are used as internal standard. The ability to quantify the protein with several of its peptides improves the reliability of the analysis. When applied to epoetin beta at expected therapeutic concentrations (about 0.5 femtomole/µL of plasma), the proposed strategy leads to a quantification limit close to 50 attomoles of epoetin beta/µL plasma, with a nano-LC-ESI-Q-TRAP mass spectrometry methodology operating in MRM. To extend the universal character of this approach to the field of pegylated protein drugs, a second therapeutic protein model has been studied. This model is a pegylated interferon alfa-2b which allowed developing a strategy for specific extraction of the drug relying on its pegylation.
-protein drugs
-mass spectrometry
-Multiple Reaction Monitoring (MRM)
-chemical isotope labelling
-quantification
-pegylated proteins
Source: http://www.theses.fr/2008BOR13686/document
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N° d'ordre : 3686




THESE

présentée à

L'UNIVERSITE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES

par Fabien XUEREB

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR

SPECIALITE : CHIMIE ANALYTIQUE ET ENVIRONNEMENT




LA SPECTROMETRIE DE MASSE APPLIQUEE A LA
QUANTIFICATION DES PROTEINES MEDICAMENTS DANS LE
PLASMA




erSoutenue le 1 Décembre 2008




Après avis de :
Mr Robert FARINOTTI Professeur, Université de Paris XI
Mr Olivier LAPREVOTE ur, Université Paris Descartes

Devant la commission d'examen formée de :
Mr Robert FARINOTTI Professeur, Université Paris-Sud XI rapporteur
Mr Olivier LAPREVOTE ur, Université Paris Descartes rapporteur
Mme Hélène BUDZINSKI Directeur de Recherches CNRS examinateur
Mme Marie-Claude SAUX Professeur, Université de Bordeaux II r
Mme Dominique BREILH ur, Université de Bordeaux II co-directeur de thèse
Mr Jean-Marie SCHMITTER Professeur, Université de Bordeaux I ur de thèse



































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Remerciements

Ce travail de thèse a été réalisé au sein de l’Institut Européen de Chimie et de Biologie
(IECB) dans l’équipe de Spectrométrie de Masse des Macromolécules Biologiques sous la
codirection du Professeur Dominique Breilh et du Professeur Jean-Marie Schmitter.

A Monsieur le Professeur Jean-Marie Schmitter
En m’accueillant dans votre équipe de Spectrométrie de Masse, vous m’avez permis de
réaliser ce travail de thèse dans des conditions optimales. Merci pour la confiance que vous
m’avez accordée pendant ces années de recherche et pour vos conseils. Grâce à vos
grandes compétences en chimie analytique, j’ai beaucoup appris à vos côtés, toujours dans
une ambiance agréable et dans une équipe toujours très dévouée. Je tiens à vous exprimer
le plaisir que j’ai ressenti à travailler avec vous. Veuillez trouver, ici, l’expression de mes très
sincères remerciements et de toute ma considération.

A Madame le Professeur Dominique Breilh
Vous avez eu l’idée de cet ambitieux travail mais dont l’aboutissement n’en a été que
meilleur. Merci de m’avoir accueilli dans votre équipe hospitalo-universitaire de pharmacie
clinique et de pharmacocinétique que vous avez toujours su maintenir en constante
évolution. Ce fut et c’est toujours un honneur et un plaisir de travailler à vos côtés étant
donnés votre dynamisme, vos compétences et votre rigueur. Vous m’avez beaucoup appris,
tant sur le plan humain que professionnel. J’espère que nous aurons encore de nombreuses
occasions de travailler ensemble. Soyez assurée de ma reconnaissance et de toute ma
considération.

A Madame Le Professeur Marie-Claude Saux
Je vous remercie de m’avoir fait l’honneur de présider mon jury de thèse. Vous m’avez
chaleureusement accueilli dans votre service de Pharmacie du Groupe Hospitalier Haut-
Lévêque au début de mon internat puis offert de poursuivre comme pharmacien. Je vous
remercie pour la confiance que vous m’avez accordée. Vous m’avez guidé et toujours très
bien conseillé durant mon cursus hospitalo-universitaire et vous m’avez donné l’occasion de
réaliser ce travail de thèse dans de très bonnes conditions. J’ai pu apprécier votre immense
savoir, votre rigueur et vos qualités humaines. Je suis fier d’en avoir bénéficié. Veuillez
trouver ici, l’expression de ma profonde gratitude et de mon admiration.


5

A Monsieur le Professeur Robert Farinotti
Je vous suis très reconnaissant d’avoir accepté d’être rapporteur de ce travail de thèse et
c’est un honneur que de vous compter parmi les membres de ce jury.

A Monsieur le Professeur Olivier Laprévote
Merci de l’intérêt que vous avez bien voulu porter à ce travail en acceptant d’être rapporteur
et de l’honneur que vous me faites en participant à ce jury.

A Madame le Docteur Hélène Budzinski
J’ai été très sensible à l’intérêt que vous avez bien voulu accorder à ce travail en acceptant
de le juger. C’est avec plaisir que je vous adresse mes très sincères remerciements.

A Stéphane Chaignepain
Merci pour ta disponibilité permanente, tes compétences, tes conseils, tes critiques, tes
encouragements et ton humour. Tu as largement pris sur ton temps de recherche pour
m’aider. Ce travail n’aurait pu aboutir sans ton aide et ton dévouement. Sois assuré de ma
profonde reconnaissance pour tout ce que tu as fait pour moi et de mon amitié la plus
sincère.

A Natalia Canelo-Vaquero
Cela a été un grand plaisir de travailler avec toi durant la dernière année de ma thèse. Merci
pour l’aide précieuse que tu m’as apportée dans la réalisation de ce travail, pour ta
gentillesse et ta joie de vivre.

A Katell Bathany, Corinne Bure, Emmanuel Geneste, Sophie Aycirieix, Armelle
Ballade, Adéline Delcambre, Yorgos Papastamoulis et Benoît Plet.
A la mémoire d’Anne Chobelet.
Ce fut un grand plaisir de travailler avec vous dans le laboratoire de spectrométrie de masse.
Merci à tous pour votre gentillesse, votre aide, votre soutien, vos conseils et vos critiques.
Vous avez tous contribué à rendre mes années de thèse bénéfiques et agréables.

Au Professeur Marc Bonneu, à Stéphane Claverol, ainsi qu’à l’équipe du Pôle
Protéomique de la Plateforme Génomique Fonctionnelle de Bordeaux
Votre collaboration à ce travail, par les analyses qui ont pu être menées avec le
TMspectromètre LTQ XL ThermoFisher, a été précieuse. J’ai pu, à plusieurs reprises,
bénéficier de vos conseils avisés. Soyez assurés de ma profonde reconnaissance.

6

A Matthias Glückmann et Christof Lenz de la société Applied Biosystems
Vous avez collaboré à ce travail par la réalisation des expériences sur l’instrument 4000 Q-
TM TRAP dont nous ne disposions pas sur le site de Bordeaux. Merci pour l’aide précieuse
que vous nous avez apportée.

A Frédéric Godde
Tu as collaboré à ce travail par la synthèse de nos réactifs de marquage chimique, éléments
clés de notre technique de dosage des protéines médicaments. Merci pour ton aide et ton
travail.

A Sarah Djabarouti, Jean-Baptiste Gordien, Jean-Marc Bernadou, Arsène Zogo, Aude
Berroneau et à toute l’équipe de la Pharmacie Centrale du Groupe Hospitalier Haut-
Lévêque
Merci pour votre soutien et pour tout ce que vous m’avez apporté dans la réalisation de ce
travail, à travers votre présence réconfortante au quotidien.

A mes parents
Vous m’avez soutenu et encouragé tout au long de ma vie et de mes études. Je ne
vous remercierai jamais assez de la gentillesse, de la patience et de l’amour qui ont
accompagné mon avancée dans ce monde. Je n’aurai, sans vous, pas pu réaliser tout
ce travail.

A mon frère, Aurélien, pour son soutien et pour tous les grands moments que nous
avons passés ensemble. Je souhaite que tes projets se concrétisent.

A mes amis et ceux qui m’ont supporté durant cette épreuve…










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Résumé

Le nombre croissant de médicaments protéiques utilisés en thérapeutique a créé des
besoins dans le domaine de leur quantification, principalement dans le plasma, un milieu de
composition protéique complexe.
Le dosage, essentiel aux études pharmacocinétique/pharmacodynamique, ainsi qu’à
l’optimisation de ces traitements, est compliqué par la nature protéique de ces médicaments
et par les faibles concentrations auxquelles ils sont attendus dans ces milieux complexes.
La méthodologie proposée se démarque des méthodes de dosage usuelles par son
caractère universel. Elle fait appel à la spectrométrie de masse adaptée à la quantification
des protéines grâce à l’utilisation d’un marquage isotopique différentiel des peptides : après
enrichissement et protéolyse, l’échantillon à doser est marqué sur les lysines par la version
légère d’un réactif de dérivation. En parallèle, les peptides de la protéine médicament pure
marqués par la version lourde du réactif, servent d’étalon interne. La possibilité de quantifier
la protéine à partir de plusieurs de ses peptides améliore la fiabilité du dosage.
Appliquée à l’epoetin beta aux concentrations attendues en thérapeutique (autour de
0,5 femtomole/µL de plasma), la stratégie proposée permet de situer la limite de
quantification à environ 50 attomoles d’epoetin beta/µL de plasma avec une méthodologie de
spectrométrie de masse nano-LC-ESI-Q-TRAP fonctionnant en mode MRM.
Pour étendre l’universalité de cette approche au champ des protéines médicaments
pégylées, une seconde molécule a été étudiée. Il s’agit de l’interféron alfa-2b pégylé qui a
permis de mettre en place une stratégie d’extraction spécifique du médicament utilisant sa
pégylation.


Mots-clés : Protéines médicaments, spectrométrie de masse, MRM, marquage chimique
isotopique, quantification, protéines pégylées.








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Abstract

The growing number of therapeutic proteins has created needs in the field of their
quantification, mainly in plasma, which is a complex protein environment.
Quantitative analysis of these proteins is essential for
pharmacokinetics/pharmacodynamics studies, and for the optimization of treatments.
However, the nature itself of the analyte and the low concentrations that are expected in
plasma complicate the quantitative analysis.
The proposed methodology differs from usual methods on its universal applicability. It
relies on mass spectrometry adapted to the quantification of proteins by using peptides
differential isotope labelling : after enrichment and proteolysis, the therapeutic protein and
the plasmatic proteins are labelled on lysine residues by the light reagent. In parallel,
peptides of the pure therapeutic protein, labelled by heavy version of reagent, are used as
internal standard. The ability to quantify the protein with several of its peptides improves the
reliability of the analysis.
When applied to epoetin beta at expected therapeutic concentrations (about 0.5
femtomole/µL of plasma), the proposed strategy leads to a quantification limit close to 50
attomoles of epoetin beta/µL plasma, with a nano-LC-ESI-Q-TRAP mass spectrometry
methodology operating in MRM.
To extend the universal character of this approach to the field of pegylated protein
drugs, a second therapeutic protein model has been studied. This model is a pegylated
interferon alfa-2b which allowed developing a strategy for specific extraction of the drug
relying on its pegylation.


Key words : protein drugs, mass spectrometry, MRM, chemical isotope labelling,
quantification, pegylated proteins.








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