Thèse doctorat

Marina Meertens

Description

THÈSE DE DOCTORAT EN SCIENCES VÉTÉRINAIRESRésuméOrientation : Médecine VétérinaireTitre de la thèse en français : Détection des contaminants viraux sanguins chez l’homme par PCRTitre de la thèse en anglais : PCR detection of blood-borne viruses in humansCandidat : Isabelle ThomasPromoteur : Prof. P. P. PastoretDépartement et Service : service de Virologie, Institut Scientifique de Santé PubliqueDate de la défense publique : le 13 décembre 2002Composition du Jury : G. Meulemans, P.-P. Pastoret, J.-P. Allain, P. Caillet-Fauquet, E. Thiry, M. Georges, J. Mainil, B. Losson, P. Lekeux.parition des anticorps). Le dépistage en PCR des donneursDESCRIPTION DU SUJET DE RECHERCHEde sang réduit la période fenêtre d’une moyenne de 59 joursABORDÉ pour HCV, de 25 jours pour HBV et de 11 jours pour HIVDe nombreux virus peuvent être transmis par le sang ou les(Schreiber et al. 1996). produits sanguins. C’est en principe vrai pour toutes lesUne fois correctement validées et standardisées, les métho-infections virales qui donnent lieu à une phase de virémie.des NAT peuvent être appliquées à différents niveaux pourLes plus importants d’un point de vue pathologique sont lesle contrôle du sang :virus de l’immunodéficience acquise (HIV), de l’hépatite C(HCV) et de l’hépatite B (HBV). Pour ces virus, il existePools de fractionnement : l’application des tests au niveaudes tests de dépistage qui permettent de repérer les don-des pools de fractionnement et l’élimination ...

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Extrait

TH»SE DE DOCTORAT EN SCIENCES V…T…RINAIRES

RÈsumÈ

Orientation :MÈdecine VÈtÈrinaire Titre de la thËse en franÁais:DÈtection des contaminants viraux sanguins chez lÕhomme par PCR Titre de la thËse en anglais:PCR detection of blood-borne viruses in humans Candidat :Isabelle Thomas Promoteur :Prof. P. P. Pastoret DÈpartement et Service:service de Virologie, Institut Scientifique de SantÈ Publique Date de la dÈfense publique:le 13 dÈcembre 2002 Composition du Jury:G. Meulemans, P.-P. Pastoret, J.-P. Allain, P. Caillet-Fauquet, E. Thiry, M. Georges, J. Mainil, B. Losson, P. Lekeux.

DESCRIPTION DU SUJET ABORD…

DE RECHERCHE

De nombreux virus peuvent Ítre transmis par le sang ou les produits sanguins. CÕest en principe vrai pour toutes les infections virales qui donnent lieu ‡ une phase de virÈmie. Les plus importants dÕun point de vue pathologique sont les virus de lÕimmunodÈficience acquise (HIV), de lÕhÈpatite C (HCV) et de lÕhÈpatite B (HBV). Pour ces virus, il existe des tests de dÈpistage qui permettent de repÈrer les don- neurs infectÈs et les Ècarter du don de sang. DÕautres virus peuvent Ègalement Ítre transmis par le sang. CÕest les cas notamment du virus de lÕhÈpatite A (HAV), du cytomÈgalo- virus (CMV) et du parvovirus B19. Ce dernier, trËs rÈpandu dans la population de donneurs, peut poser de graves pro- blËmes chez certains individus, notamment les patients immunodÈprimÈs et les femmes enceintes (Anandet al. 1987). De plus, la crainte de lÕapparition de nouveaux pathogËnes Èmergeants qui pourraient affecter la sÈcuritÈ du sang persiste. Depuis le dÈveloppement rÈcent des techniques de biologie molÈculaire, toute une sÈrie de nouveaux virus ont ÈtÈ dÈcouverts et leur importance au niveau transfusionnel doit Ítre dÈterminÈe en fonction de diffÈrents critËres tels que la pathogÈnicitÈ, la prÈvalence, la transmissibilitÈ, la persistance ainsi que lÕexistence de moyens de dÈtection.

Pour minimiser au maximum les risques de contamination virales par transfusion, lÕutilisation des tests dÕamplifica- tion des acides nuclÈiques (NAT) a ÈtÈ proposÈe en complÈ- ment des tests sÈrologiques utilisÈs en routine. Les avanta- ges de ces techniques sont leur grande sensibilitÈ, leur spÈcificitÈ, leur capacitÈ ‡ dÈtecter directement le gÈnome viral au lieu des anticorps ou des antigËnes. LÕavantage le plus important dans le domaine de la transfusion est leur capacitÈ ‡ rÈduire fortement la pÈriode fenÍtre (avant lÕap-

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parition des anticorps). Le dÈpistage enPCR des donneurs de sang rÈduit la pÈriode fenÍtre dÕune moyenne de 59 jours pour HCV, de 25 jours pour HBV et de 11 jours pour HIV (Schreiber et al. 1996).

Une fois correctement validÈes et standardisÈes, les mÈtho- des NAT peuvent Ítre appliquÈes ‡ diffÈrents niveauxpour le contrÙle du sang:

Pools de fractionnement: lÕapplication des tests au niveau des pools de fractionnement et lÕÈlimination des pools contaminÈs au del‡ dÕun seuil de dÈtection dÈterminÈ per- met de garantir une charge virale minimale compatible avec les techniques dÕinactivation/Èlimination virale utili- sÈes.La sensibilitÈ exigÈe varie fortement en fonction du type de virus. Le nombre de tests est rÈduit, ce qui diminue fortement les co˚ts. Cependant, la perte engendrÈe par la destruction dÕun grand pool de fractionnement est impor- tante dÕun point de vue Èconomique et Èthique (perte dÕun grand nombre de dons non infectieux).

Dons individuels: lÕidÈal serait bien s˚r de tester les dons individuels, pour permettre lÕÈlimination directe des dons contaminÈs et la notification rapide des donneurs. Actuellement pour des raisons de co˚ts et de logistique, ces tests individuels ne sont pas encore applicables en routine ‡ de grandes quantitÈs dÕÈchantillons.

Minipoolspermettentminipools ª: les tests effectuÈs sur ´ de rÈduire le nombre de tests ‡ effectuer sans trop affecter la sensibilitÈ (dilution des Èchantillons). La sensibilitÈ du test ‡ utiliser et la taille des ´minipools ªdoivent Ítre Èta- blis en fonction du type dÕagent ‡ rechercher. DiffÈrentes tailles de pools (8 ‡ 500), diffÈrents systËmes de pooling (2, 3 dimensions) ont ÈtÈ dÈveloppÈs et testÈs. Chaque pool trouvÈ positif doit Ítre rÈsolu pour identifier le don respon- sable de la contamination.

RESULTATS Deux cent et six Èchantillons nous ont ÈtÈ envoyÈs pour analyse PCR HCV ‡ la suite dÕun rÈsultat positif pour le Dans le cadre de ce travail quatre virus transmissibles par dÈpistage ELISA anti-HCV. Tous les Èchantillons testÈs se le sang ont ÈtÈ abordÈs plus particuliËrement. Chacune des sont rÈvÈlÈs nÈgatifs en PCR quel que soit leur profil sÈro- Ètudes rÈalisÈes est rÈsumÈe ci-dessous logique. DÕautres Ètudes rÈalisÈes dans ce domaine ont montrÈ que dans la majoritÈ des cas, les donneurs prÈsen- HCV tant une rÈactivitÈ unique vis-‡-vis des antigËnes NS4 ou DÈtection par PCR de lÕARN du virus HCV dans des NS5 ne sont pas infectieux alors quÕun trËs faible pourcen- pools de plasma tage de donneurs rÈactifs soit vis-‡-vis du core ou de lÕanti- gËne NS3 sont positifs en PCR (Dowet al.1996). Durant la pÈriode fenÍtre, estimÈe ‡ 70 jours pour le virus HCV, les donneurs infectÈs peuvent transmettre lÕinfection LÕutilisation de la PCR a permis de rassurer les donneurs (Vrielinket al. concernÈs et dÕempÍcher leur exclusion du circuit du don 1995). La durÈe de cette pÈriode fenÍtre peut Ítre considÈrablement rÈduite par lÕutilisation des tests de sang. NAT. HBV Les objectifs de lÕÈtude Ètaient de dÈterminer la prÈvalence des pools positifs en PCR pour HCV, de valider notre DÈtection duvirus HBV par PCR chez des donneurs mÈthode PCR et dÕamÈliorer la sÈcuritÈ des produits plas- anti-HBc positifs matiques. LÕinfection ‡ HBV est normalement associÈe ‡ la prÈsence Trois cent soixante sept pools de plasma(chacun consti- de lÕantigËne de surface du virus de lÕhÈpatite B (HBsAg) tuÈs de 5000 dons individuels) du DCF (Croix-Rouge de dans le sÈrum. Depuis la gÈnÈralisation des tests de dÈpis- Belgique) ont ÈtÈ testÈs dÕavril 1996 ‡ dÈcembre 1998. tage de lÕHBsAg chez les donneurs, lÕincidence des hÈpati- Deux pools dÕentre eux ont ÈtÈ trouvÈs HCV ARN positifs tes post-transfusionnelles ‡ HBV a fortement diminuÈ sans et ÈliminÈs. DÕautre part, trois dons successifs dÕun don- totalement disparaÓtre. Il persiste des cas qui peuvent Ítre neur ayant prÈsentÈ une sÈroconversion au mois de mai expliquÈs par des dons effectuÈs durant la pÈriode fenÍtre e 1997 nous ont ÈtÈ envoyÈs pour analyse. Le 3don ainsi avant lÕapparition de lÕantigËne HBsAg, par le caractËre e e que le 2Ètaient positifs en PCR. Le 3don, positif en sÈro- parfois transitoire de lÕantigÈnÈm,iepar la prÈsence du mar- logie, avait ÈtÈ ÈliminÈ mais le deuxiËme, nÈgatif en sÈrolo- queur HBsAg ‡ des taux infÈrieurs au seuil de dÈtection gie (don de prÈsÈroconversion), avait ÈtÈ incorporÈ dans un chez les porteurs HBV chroniques ou par lÕexistence de pool. La procÈdure de´ lookback ªa permis dÕidentifier mutants. En Belgique, les tests anti-HBc sont obligatoires ce pool, qui Ètait en fait lÕun des deux pools trouvÈs positifs pour les nouveaux donneurs et en cas de positivitÈ pour ce prÈcÈdemment. Le gÈnotype de ce pool et du don a ÈtÈ marqueur, les donneurs sont exclus dËs que le taux dÕanti- dÈterminÈ :il Ètait pour les deux du type 5a, un gÈnotype corps anti-HBs est infÈrieur ‡ 50 mUI/ml. Le problËme rare en Europe. LÕapplication de la PCR HCV aux plasmas principal associÈ ‡ ces tests est leur faible spÈcificitÈ. de fractionnement permet de dÈtecter de rares cas positifs Les objectifs de cette Ètude Ètaient dÕestimer la prÈvalence ayant ÈchappÈ ‡ toute la procÈdure de dÈpistage etde de lÕADN HBV dans diffÈrentes populations de donneurs, garantir ainsi une charge virale minimale compatible avec et dÕestimer la charge virale des donneurs positifs. les procÈdures dÕinactivation utilisÈes pendant la fabrica- tion des produits. Parmi les 473 donneurs testÈs 378 ont ÈtÈ confirmÈs anti- HBc positifs. Tous les nouveaux donneurs positifs pour DÈtection de lÕARN du virus HCV chez des donneurs ‡ lÕHBsAg ont ÈtÈ dÈtectÈs positifs en PCR. profil sÈrologique indÈterminÈ Un Èchantillon PCR positif anti-HBc nÈgatif, Ètait un Les pratiques des tests de dÈpistage du virus HCV dans les Èchantillon de sÈroconversion. centres de transfusion sont pratiquement identiques dans Les deux autres Èchantillons PCR positifs provenaient de tous les pays dÕEurope. Un premiertest de dÈpistagede donneurs anti-HBc positifs. Les charges virales de ces deux type ELISA est rÈalisÈ et rÈpÈtÈ deux fois si le rÈsultat est Èchantillons Ètaient faibles (100 ‡ 1000 geq/ml). Il pourrait positif. Si deux tests sur les trois sont positifs, untest de sÕagir de donneurs chroniques dÈpourvus dÕHBsAg. confirmationest rÈalisÈ basÈ sur une technique dÕimmuno- blotting (RIBA). Si le rÈsultat du test est positif, le don est HAV ÈliminÈ et le donneur est prÈvenu. Si le rÈsultat du test est nÈgatif, le don correspondant est ÈliminÈ mais le donneur, DÈtection de lÕARN du virus HAV dans le sang et les considÈrÈ comme sain,sera rappelÈ pour un don ultÈrieur. produits sanguins Dans certains cas, le rÈsultat reste indÈterminÈ et la seule LÕhÈpatite A reste un problËme de santÈ publique prÈoccu- maniËre de dÈterminer le statut virÈmique ou non du don- pant. La voie principale de contamination est la voie fÈcale neur est lÕutilisation dÕune PCR. orale. La transmission par le sang est Ègalement possible Les objectifs de notre lÕÈtude Ètaient de dÈterminer la pro- puisquÕil existe une phase de virÈmie transitoire au dÈbut portion de donneurs RIBA indÈterminÈs positifs pour de lÕinfection. Le virus est non enveloppÈ et particuliËre- lÕARN HCV, en relation avec la protÈine rÈactive.ment rÈsistant aux processus dÕinactivation virale utilisÈs

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couramment. Il peut donc se retrouver dans les produitsla rÈsolution des pools positifs et lÕÈlimination des dons finis. Des ÈpidÈmies liÈes ‡ lÕadministration de facteurs de contaminÈs assurent que la charge virale au niveau des 3 coagulation chez des patients hÈmophiles ont ÈtÈ rappor- pools de fractionnement (5000 dons) reste infÈrieure ‡ 10 tÈes dans diffÈrents pays europÈens. UI/ml, une charge virale compatible avec lÕefficacitÈ des procÈdures dÕinactivation. Les objectifs de notre Ètude Ètaient de rechercher la prÈ- sence du gÈnome viral dans diffÈrents types dÕÈchantillons: Èchantillons de patients ‡ profils sÈrologiques HAV dÈter- CONCLUSIONS minÈs, pools de fractionnement, facteurs de coagulation (lots impliquÈs dans des cas de contamination chez des Les tests NAT peuvent Ítre utilisÈs pour dÈtecter la plupart patients hÈmophiles en Belgique.) des virus transmis par le sang. Cependant, lÕutilitÈ, lÕimpor- tance et les modalitÈs dÕutilisation des tests dÈpendent de Tous les Èchantillons de patients nÈgatifs pour les IgM anti- diffÈrents facteurs spÈcifiques au type de virus. Ces fac- HAV (IgTot positifs ou IgTot nÈgatifs) Ètaient nÈgatifs en teurs importants sont la prÈvalence, la pathogÈnicitÈ, la PCR. Tous les Èchantillons de patients positifs pour les IgM charge virale durant la phase de virÈmie, le temps de multi- anti-HAV Ètaient positifs en PCR. Ces donnÈes suggËrent plication du virus et la dose infectieuse. Pour les plus que la phase de virÈmie pourrait Ítre relativement longue. importants de ces virus, les Ètudes que nous avons rÈalisÈes Les trente pools de fractionnement (5000 dons individuels) ainsi que la revue de la littÈrature nous permettent de tirer testÈs, Ètaienttous nÈgatifs en PCR. certaines conclusions. Quatre lots de facteur VIII suspectÈs dans des cas de conta- Le virus HCVa ÈtÈ le premier ‡ Ítre envisagÈ pour lÕutili- minations, ainsi que les pools de plasma correspondants ont sation des tests NAT, ‡ cause de sa prÈvalence ÈlevÈe, la ÈtÈ testÈs et trouvÈs nÈgatifs en PCR. Ces rÈsultats suggË- durÈe de sa pÈriode fenÍtre, et la charge virale ÈlevÈe rent que la contamination des concentrÈs de facteur VIII 5 7 durant la phase de virÈmie (de 10‡ 10UI/ml). Les pre- par le virus HAV reste un ÈvÈnement rare. miËres estimations des risques rÈsiduels Ètaient ÈlevÈes, de Quoi quÕil en soit, le fait de lÕexistence dÕune pÈriode de lÕordre de 1/130.000 dons testÈs avec les mÈthodes sÈrolo- virÈmie de durÈe non nÈgligeable, impose de rester trËs giques courantes. Les premiers tests rÈalisÈs sur des pools attentif au risque. En absence de traitement qui inactive le de fractionnement ont montrÈ que de 0% ‡ 19% des pools virus, du sang contaminÈ par HAV, collectÈ chez des don- europÈens et jusquÕ‡ 51% des pools provenant des Etats- neurs asymptomatique peut transmettre lÕinfection. Unis Ètaient positifs en PCR. DËs lors, une rÈglementation du CPMP de lÕagence europÈenne du mÈdicament (EMEA) Parvovirus B19 a ÈtÈ Ètablie et impose que seuls les produits issus des pools de fractionnement testÈs et trouvÈs nÈgatifs par une techni- DÈtection du Parvovirus B19 par PCR dans des pools que NAT dÕune sensibilitÈ de 100 UI/ml peuvent Ítre mis de plasma et corrÈlation avec le statut sÈrologique des sur le marchÈ. Lors de notre Ètude sur les pools de fraction- donneurs positifs. nement de la Croix-Rouge en Belgique, de avril 1996 ‡ Le parvovirus humain B19 est actuellement reconnu dÈcembre 1998, nous avons trouvÈ 2/367 pools positifs comme un contaminant majeur du sang et des produits san- (0,6 %).Depuis cette pÈriode, plus de 800 pools de produc- guins. Pour rÈduire le risque de contamination, le dÈpistage tion ont ÈtÈ testÈs et un seul a ÈtÈ trouvÈ HCV PCR positif. au niveau des pools de plasma et lÕexclusion des dons ‡ A vrai dire, en raison du facteur de dilution, un rÈsultat charge virale ÈlevÈe ont ÈtÈ recommandÈs. Des pools de nÈgatif ne permet pas de prouver lÕabsence de contamina- tailles diffÈrentes ont ÈtÈ testÈs pour B19 ‡ lÕaide dÕune nes- tion. Cependant, lÕapplication de ces tests permet dÕassurer ted-PCR trËs sensible. Les pools positifs ont ÈtÈ rÈsolu jus- une charge virale minimale compatible avec les mÈthodes quÕau don individuel, la charge virale et les marqueurs dÕÈlimination/inactivation virale utilisÈes durant la fabrica- sÈrologiques ont ÈtÈ dÈterminÈs. Sur 16.850 dons, 27 tion des produits.La perte engendrÈe par la destruction (1/625) Ètaient positifs pour lÕADN B19 avec des charges dÕun grand pool est importante, non seulement dÕun point 2 7 virales variant de 10‡ plus de 10UI/ml. Parmi les dons de vue Èconomique, mais Ègalement dÕun point de vue Èthi- positifs testÈs vis-‡-vis des protÈines VP, 32% Ètaient que car elle entraÓne lÕÈlimination dÕun grand nombre dÈpourvus dÕanticorps et Ètaient donc probablement soit en dÕunitÈs qui pourraient Ítre transfusÈes en toute sÈcuritÈ. pÈriode fenÍtre de prÈsÈroconversion soit des porteurs Pour rÈsoudre ce problËme, les producteurs sont encoura- chroniques dÈpourvus dÕanticorps dÈtectables. Les 28% gÈs ‡ tester dans une premiËre Ètape des minipools. Dans de donneurs IgM positifs peuvent Ítre considÈrÈs comme Ètant nombreux pays, les tests NAT pour HCV sont devenus en phase prÈcoce de lÕinfection. Les 40% donneurs restants obligatoires au niveau des centres de transfusion pour la (IgM nÈgatifs, IgG positifs) sont probablement porteurs libÈration des globules rouges et des plaquettes. dÕinfection persistante (PCR positifs malgrÈ la prÈsence Actuellement, en attendant le dÈveloppement de techniques des anticorps IgG) comme suggÈrÈ par la faible charge qui permettraient les tests individuels, ces tests sont rÈalisÈs virale. Parmi les 36 ´Major poolsª testÈs, 12 Ètaient posi- en minipools de tailles variables.JusquÕ‡ prÈsent les rÈsul- tifs en nested-PCR et seulement 3 en simple PCR suggÈrant tats rapportÈs par la plupart des pays suggËrent que le 4 une charge virale supÈrieure ‡ 10 IU/ml.La rÈalisation de nombre dÕÈchantillons en pÈriode fenÍtre est beaucoup plus tests ‡ lÕaide dÕune rÈaction dePCR sur des pools de 480,faible quÕinitialement prÈvu.

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Pour le virus HIV, le risque rÈsiduel de contamination est moins ÈlevÈ que pour HCV. Ce qui peut Ítre expliquÈ en partie par sa plus faible prÈvalence au niveau de la popula- tion de donneurs, la durÈe plus courte de la pÈriode fenÍtre et la charge virale moins ÈlevÈe avant sÈroconversion. Des Ètudes rÈalisÈes ont montrÈ que le co˚t bÈnÈfice de ces tests Ètait trËs ÈlevÈ, du moins dans les pays ‡ faible prÈvalence. MalgrÈ cela, de nombreux producteurs rÈalisent les tests sur les pools de fractionnement. Les tests sont Ègalement rÈalisÈs sur des minipools dans les centres de transfusion de plusieurs pays europÈens. Le problËme de la taille de ces pools est cependant trËs important si lÕon veut atteindre une sensibilitÈ suffisante. Un exemple du problËme sÕest prÈ- sentÈ rÈcemment en France ou les tests PCR pour HCV et HIV sont obligatoires depuis juillet 2001. MalgrÈ lÕutilisa- tion des tests, un cas de contamination a ÈtÈ notÈ et un Èchantillon positif en sÈrologie nÕa pas ÈtÈ dÈtectÈ. LÕanalyse rÈtrospective des Èchantillons a dÈmontrÈ une charge virale extrÍmement faible pour ces deux Èchantil- lons, qui nÕauraient pu Ítre dÈtectÈs quÕavec une mÈthode trËs sensible et en testant le don individuel.

Le risque rÈsiduel de transmission duvirus HBVest du mÍme ordre de grandeur que pour le virus HCV. En plus de la pÈriode fenÍtre qui constitue le problËme le plus impor- tant, il existe des porteurs chroniques ‡ trËs faible taux dÕHBsAg et des mutants non dÈtectÈs par les tests de rou- tine. Le temps de multiplication (temps de doublement) du virus est faible (4 jours) et la charge virale est plus faible durant la sÈroconversion que pour HCV et HIV. Le virus est donc trËs difficile ‡ dÈtecter dans les grands pools de production et mÍme dansles minipools et seul le dÈpistage au niveau individuel vaut la peine dÕÍtre envisagÈ. Lors de notre Ètude effectuÈe chez des donneurs nÈgatifs pour HBsAg nous avons dÈtectÈ un Èchantillon en pÈriode de prÈsÈroconversion et deux Èchantillons PCR positifs qui pourraient Ítre des porteurs chroniques ‡ charge virale trËs faible.

Le virus HAVest non enveloppÈ, non dÈtectÈ par sÈrologie chez les donneurs et peut contaminer des pools de plasma et des produits. Il existe en effet une pÈriode de virÈmie qui semble plus longue quÕon ne le pensait au dÈpart et durant 5 laquelle la charge virale peut atteindre 10geq/ml. Des cas de contaminations ont ÈtÈ notÈs principalement chez des hÈmophiles traitÈs par des facteurs de coagulation. Cependant la maladie est en gÈnÈral assez bÈnigne et il existe des vaccins disponibles qui peuvent Ítre administrÈs aux receveurs ‡ haut risque tels que les hÈmophiles et les polytransfusÈs. A lÕheure actuelle, les tests NAT ne sont donc pas recommandÈs pour ce virus. Cependant, ils se sont rÈvÈlÈs trËs utiles dans les Ètudes ÈpidÈmiologiques pour mettre en Èvidence la transmission du virus chez certains patients (dÈtection du virus dans les pools, les produits et chez les patients et sÈquenÁage ultÈrieur de la souche).

Le Parvovirus B19ne provoque en gÈnÈral pas de maladie grave chez les patients immunocompÈtents, par contre il peut entraÓner des problËmes trËs graves chez les femmes enceintes et chez les patients immunodÈprimÈs. Ce virus

est clairement transmissible par le sang. Il est non enve- loppÈ, etprÈsent dans les plasmas individuels (prÈvalence 1/625 dans notre Ètude), dans les pools de fractionnement ainsi que dans la plupart des produits. Des charges virales ÈlevÈes peuvent Ítre dÈtectÈes au niveau des pools. Des sÈroconversions ainsi que des signes cliniques ont ÈtÈ notÈs chez des receveurs ‡ partir de charges virales supÈrieures ‡ 3,5 10 copie/ml.CÕest pourquoi la FDA recommande de tes- ter les pools de fractionnement de maniËre ‡ ne garder que 4 ceux dont la charge est infÈrieure ‡ 10 copies/ml.

LÕÈtude rÈalisÈe nous a permis de mettre au point unestra- tÈgie de dÈpistage du Parvovirus B19 au niveau des pools qui est dÈj‡ utilisÈe en routine par le DÈpartement Central de Fractionnement de la Croix-Rouge de Belgique. Une premiËre PCR (sensibilitÈ de 4000 UI/ml) est rÈalisÈe sur les pools de 480. Les poches correspondant auxpools nÈgatifs sont directement libÈrÈes pour le fractionnement. Les pools positifs sont rÈsolus jusquÕau don individuel. JusquÕ‡ prÈsent, plus de 50.000 dons ont ÈtÈ testÈs et 4 pools positifs ont ÈtÈ dÈtectÈs.

PERSPECTIVES

La sÈcuritÈ du sang nÕa jamais ÈtÈ aussi ÈlevÈe quÕactuelle- ment, surtout au niveau des risques virologiques. MalgrÈ toutes les mesures de prÈcaution appliquÈes, de faibles ris- ques rÈsiduels persistent et les tests NAT peuvent contri- buer ‡ les rÈduire encore considÈrablement. Des rÈglemen- tations ont ÈtÈ Ètabliespour assurer la sÈcuritÈ virale des produits et des dons destinÈs ‡ la transfusion. Les tests NAT sont devenus obligatoires sur les pools de fractionnement pour les virus de lÕhÈpatite C et pour le parvovirus B19 (prÈparation des immunoglobulines anti-D). Au niveau des centres de transfusion, les tests sont devenus obligatoires pour les virus HCV et HIV, dans plusieurs pays europÈens. De nombreuses Ètudes ont ÈtÈ rÈalisÈes depuis quelques annÈes et les progrËs dans la standardisation et la validation permettent dÕenvisager lÕÈtablissement des tests ‡ une plus grande Èchelle. La difficultÈ de leur mise en application nÈcessite une attention constante qui doit Ítre focalisÈe sur la rÈduction du nombre de faux positifs, de faux nÈgatifs ainsi que des sÈries de tests invalides. Quels que soient ces problËmes, lÕÈpidÈmiologie de ces infections transmissibles par le sang doit Ítre ÈtudiÈe et ÈvaluÈe rÈguliËrement et les techniques de biologie molÈculaires reprÈsentent un outil particuliËrement appropriÈ.

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R…F…RENCES PUBLICATIONSISSUES DU TRAVAIL DE TH»SE ANAND A, GRAY ES, BROWN T, CLEWLEY JP,Thomas I., Branckaert T., Mathys E., Vranckx R., Laub R. COHEN BJ. Human parvovirus infection in pregnancyPCR detects HCV genotype 5a in a plasma pool contam- and hydrops fetalis.N. Engl. J. Med., 1987,316, 183-6.inated by a single preseroconverted donation Vox Sang., 2000,79, 69-71. DOW BC, BUCHANAN I, MUNRO H, FOLLETT EA, DAVIDSON F, PRESCOTT LE, YAP PL, SIMMONDSThomas I, Mathys E, Gerard C. The use of nucleic acid P. Relevance of RIBA-3 supplementary test to HCVamplification techniques to increase the viral safety of PCR positivity and genotypes for HCV confirmation ofblood.Clin Lab., 2002,48, 155-60. blood donors. J. Med. Virol.,1996,49, 132-6. Allain J.P.Thomas I, Sauleda S., Nucleic acid testing for SCHREIBER GB, BUSCH MP, KLEINMAN SH,emerging viral infections.Transf. Med., 2002,12, 275- KORELITZ JJ. The Risk of Transfusion-Transmitted283. Viral Infections.N. Engl. J. Med., 1996,334, 1685-90. Thomas I., Di Giambattista M., GÈrard C., Mathys E., VRIELINK H, VAN DER POEL CL, REESINK HW,Hougardy V., Latour B., Branckaert Th., and Laub R. ZAAIJER HL, LELIE PN. Transmission of hepatitis CPrevalence of human erythrovirus B19 DNA in healthy virus by anti-HCV-negative blood transfusion. CaseBelgian blood donors and correlation with specific anti- report.Vox Sang., 1995,68bodies against structural and nonstructural viral proteins, 55-6. Vox Sang., 2003,84, 300-307.

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