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Method development for the analysis of bioactive lipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS) [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Max Scherer

De
174 pages
Method development for the analysis of bioactive lipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV-Chemie und Pharmazie – der Universität Regensburg vorgelegt von Max Scherer aus Hamburg 2010 Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von November 2007 bis September 2010 in der Abteilung für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin des Klinikums der Universität Regensburg unter der Anleitung von Prof. Dr. G. Schmitz. Das Promotionsgesuch wurde eingereicht im September 2010 Tag der mündlichen Prüfung: 9.11.2010 Prüfungsausschuss: Prof. Dr. J. Wegener (Vorsitzender) Prof. Dr. O. S. Wolfbeis (Erstgutachter) Prof. Dr. G. Schmitz (Zweitgutachter) Prof. Dr. F.-M. Matysik (Drittprüfer) Danksagung Zum Gelingen dieser Arbeit haben viele Leute beigetragen durch wertvolle Ratschläge, wissenschaftliche Diskussionen, tatkräftige Unterstützung und einer gehörigen Portion Geduld: Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. Gerhard Liebisch für die Bereitstellung des sehr interessanten Themas, die Hilfe bei der inhaltlichen Gestaltung dieser Arbeit, die hervorragende wissenschaftliche Betreuung und die stetige Diskussionsbereitschaft.
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Method development for the analysis of bioactive
lipids by liquid chromatography tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS)




Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV-Chemie und Pharmazie – der
Universität Regensburg






vorgelegt von
Max Scherer
aus Hamburg
2010



Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von November 2007 bis September 2010
in der Abteilung für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin des Klinikums der
Universität Regensburg unter der Anleitung von Prof. Dr. G. Schmitz.















Das Promotionsgesuch wurde eingereicht im September 2010

Tag der mündlichen Prüfung: 9.11.2010

Prüfungsausschuss:
Prof. Dr. J. Wegener (Vorsitzender)
Prof. Dr. O. S. Wolfbeis (Erstgutachter)
Prof. Dr. G. Schmitz (Zweitgutachter)
Prof. Dr. F.-M. Matysik (Drittprüfer)




Danksagung

Zum Gelingen dieser Arbeit haben viele Leute beigetragen durch wertvolle
Ratschläge, wissenschaftliche Diskussionen, tatkräftige Unterstützung und einer
gehörigen Portion Geduld:

Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. Gerhard Liebisch für die Bereitstellung des
sehr interessanten Themas, die Hilfe bei der inhaltlichen Gestaltung dieser Arbeit,
die hervorragende wissenschaftliche Betreuung und die stetige
Diskussionsbereitschaft.
Ohne die herzliche Aufnahme in Deine Forschungsgruppe, Dein stetiges Interesse
an meiner Arbeit sowie Deine Hilfsbereitschaft zu jeder Zeit wäre diese Arbeit nicht
möglich gewesen.

Mein besonderer Dank gilt weiterhin Herrn Prof. Dr. Gerd Schmitz, Direktor des
Instituts für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin, Klinikum der Universität
Regensburg, für die Unterstützung und Förderung dieser Arbeit, die Bereitstellung
des interessanten Themas sowie die hervorragende Laborausstattung.

Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. Otto Wolfbeis für die Übernahme der Betreuung
an der naturwissenschaftlichen Fakultät, sowie die Erstellung des Gutachtens.

Mein ganz besonderer Dank gilt außerdem Simone, Doreen, Jolanthe, Bettina, Uschi
Jürgen und Annette für Ihre stetige Hilfsbereitschaft und das freundliche und
angenehme Arbeitsklima.

Ich bedanke mich außerdem bei allen weiteren Mitarbeitern des Instituts für Klinische
Chemie für das lockere, freundschaftliche Arbeitsklima und die allseits vorhandene
Hilfsbereitschaft.

Der größte Dank gilt meinen Eltern und meiner Freundin Marion für die
Unterstützung zu jeder Zeit und in allen Lebenslagen.


Schließlich danke ich auch allen Freunden und Bekannten für ihre Unterstützung
während dieser Zeit.




TABLE OF CONTENTS
1 GENERAL INTRODUCTION ................................................................................... 1
1.1 Mass spectrometry of lipids .................................................................................................... 1
1.1.1 Electrospray Ionization (ESI).................................................................................................. 1
1.1.2 Tandem mass spectrometry in lipidomics .............................................................................. 2
1.1.3 Linear ion trap mass spectrometry ......................................................................................... 4
1.2 Chromatography ....................................................................................................................... 5
1.3 Biological background ............................................................................................................. 7
1.3.1 Glycerophospholipids ............................................................................................................. 8
1.3.1.1 The metabolism of polyglycerophospholipids in mammalian cells ................................ 9
1.3.1.2 The function of polyglycerophospholipids ................................................................... 10
1.3.1.3 Role of polyglycerophospholipids in specific pathologies ........................................... 12
1.3.1.4 Quantitative analysis of cardiolipin and metabolites by tandem mass-spectrometry .. 14
1.3.2 Sphingolipids ........................................................................................................................ 15
1.3.2.1 Structure and metabolism ........................................................................................... 15
1.3.2.2 Sphingolipids as bioactive molecules .......................................................................... 18
1.3.2.3 Sphingolipids in disease .............................................................................................. 19
1.3.2.4 Mass spectrometric analysis of sphingolipid species .................................................. 21
1.3.3 Bile acids .............................................................................................................................. 22
1.3.3.1 Structure and biosynthesis .......................................................................................... 22
1.3.3.2 Enterohepatic circulation ............................................................................................. 25
1.3.3.3 Roles of nuclear hormone receptors ........................................................................... 26
1.3.3.4 Bile acids in diseases .................................................................................................. 26
1.3.3.5 Bile acids analysis by LC-MS/MS ................................................................................ 28
1.4 Scope and Objectives ............................................................................................................ 29
1.5 References .............................................................................................................................. 31
2 SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF CARDIOLIPIN,
BIS(MONOACYLGLYCERO)PHOSPHATE AND THEIR PRECURSORS BY
HYDROPHILIC INTERACTION LC-MS/MS INCLUDING CORRECTION OF
ISOTOPIC OVERLAP .............................................................................................. 40
2.1 Abstract ................................................................................................................................... 40
2.2 Introduction ............................................................................................................................. 40

2.3 Experimental section ............................................................................................................. 41
2.3.1 Reagents .............................................................................................................................. 41
2.3.2 Sample preparation .............................................................................................................. 41
2.3.3 HILIC-MS/MS ....................................................................................................................... 42
2.3.4 Calibration ............................................................................................................................ 43
2.3.5 Species identification ........................................................................................................... 43
2.3.6 Correction of isotopic overlap .............................................................................................. 43
2.4 Results and discussion ......................................................................................................... 44
2.4.1 Fragmentation of CL and related lipids ................................................................................ 44
2.4.2 Chromatography .................................................................................................................. 45
2.4.3 Correction of isotope overlap ............................................................................................... 47
2.4.4 Quantification ....................................................................................................................... 51
2.4.5 Method validation ................................................................................................................. 51
2.5 Conclusion .............................................................................................................................. 51
2.6 References .............................................................................................................................. 53
2.7 Supporting Information.......................................................................................................... 56
3 HIGH THROUGHPUT ANALYSIS OF SPHINGOSINE-1-PHOSPHATE,
SPHINGANINE-1-PHOSPHATE AND LYSOPHOSPHATIDIC ACID IN PLASMA
SAMPLES BY LC-MS/MS ........................................................................................ 61
3.1 Abstract ................................................................................................................................... 61
3.2 Introduction ............................................................................................................................. 62
3.3 Materials and Methods ........................................................................................................... 62
3.3.1 LC-MS/MS analysis .............................................................................................................. 62
3.3.2 Species identification ........................................................................................................... 63
3.3.3 Sample preparation .............................................................................................................. 64
3.4 Results and Discussion ......................................................................................................... 64
3.4.1 Chromatography .................................................................................................................. 64
3.4.2 Validation.............................................................................................................................. 65
3.4.3 Quantification ....................................................................................................................... 65
3.4.4 Precision............................................................................................................................... 67
3.4.5 Sample stability .................................................................................................................... 69
3.4.6 S1P and LPA level in human EDTA-plasma ........................................................................ 69
3.5 Conclusion .............................................................................................................................. 69


3.6 References .............................................................................................................................. 71
3.7 Data Supplement .................................................................................................................... 73
4 A RAPID AND QUANTITATIVE LC-MS/MS METHOD TO PROFILE
SPHINGOLIPIDS ..................................................................................................... 82
4.1 Abstract ................................................................................................................................... 82
4.2 Introduction ............................................................................................................................. 83
4.3 Material and Methods ............................................................................................................. 84
4.3.1 Chemicals and solutions ...................................................................................................... 84
4.3.2 Cell culture ........................................................................................................................... 86
4.3.3 Sample preparation .............................................................................................................. 86
4.3.4 Sphingolipid analysis by LC-MS/MS .................................................................................... 86
4.3.5 Calibration and quantification ............................................................................................... 87
4.3.6 Analysis of sphingosine-1-phosphate, ceramide and sphingomyelin .................................. 88
4.4 Results ..................................................................................................................................... 88
4.4.1 Sphingolipid fragmentation................................................................................................... 88
4.4.2 Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) of sphingolipids ........................................ 90
4.4.3 Extraction efficiency and matrix effects ................................................................................ 93
4.4.4 Quantification of sphingolipid species .................................................................................. 94
4.4.5 Assay characteristics ........................................................................................................... 97
4.4.6 Preparation of cell culture samples and sample stability ................................................... 101
4.4.7 Analysis of fibroblasts treated with myriocin/sphingosine-kinase inhibitor ........................ 102
4.5 Discussion ............................................................................................................................ 104
4.6 References ............................................................................................................................ 106
5 SPHINGOLIPID PROFILING OF HUMAN PLASMA AND FPLC-SEPARATED
LIPOPROTEIN FRACTIONS BY HYDROPHILIC INTERACTION
CHROMATOGRAPHY TANDEM MASS SPECTROMETRY ................................. 110
5.1 Abstract ................................................................................................................................. 110
5.2 Introduction ........................................................................................................................... 111
5.3 Material and Methods ........................................................................................................... 111
5.3.1 Subjects.............................................................................................................................. 111
5.3.2 Sample preparation ............................................................................................................ 112

5.3.3 Sphingolipid quantification by LC-MS/MS .......................................................................... 112
5.3.4 Lipoprotein separation by FPLC ........................................................................................ 114
5.3.5 Preparation of lipoproteins by ultracentrifugation .............................................................. 114
5.4 Results ................................................................................................................................... 114
5.4.1 Sphingolipid species of human EDTA-plasma ................................................................... 114
5.4.2 Validation of plasma sphingolipid analysis ......................................................................... 118
5.4.3 Plasma level of sphingolipid species ................................................................................. 119
5.4.4 Sphingolipid distribution on lipoprotein fractions ................................................................ 123
5.5 Discussion ............................................................................................................................ 125
5.6 References ............................................................................................................................ 128
6 RAPID QUANTIFICATION OF BILE ACIDS AND THEIR CONJUGATES IN
SERUM BY LIQUID CHROMATOGRAPHY–TANDEM MASS SPECTROMETRY 131
6.1 Abstract ................................................................................................................................. 131
6.2 Introduction ........................................................................................................................... 132
6.3 Material and Methods ........................................................................................................... 133
6.3.1 Chemicals and solutions .................................................................................................... 133
6.3.2 Samples and sample preparation ...................................................................................... 133
6.3.3 LC-MS/MS analysis ............................................................................................................ 134
6.3.4 Calibration and quantification ............................................................................................. 134
6.4 Results ................................................................................................................................... 135
6.4.1 Fragmentation of BAs ........................................................................................................ 135
6.4.2 Analysis of BAs by LC-MS/MS ........................................................................................... 136
6.4.3 Matrix effects ...................................................................................................................... 138
6.4.4 Quantification ..................................................................................................................... 138
6.4.5 Assay characteristics ......................................................................................................... 139
6.4.6 Quantitation of plasma and serum BAs ............................................................................. 142
6.5 Discussion ............................................................................................................................ 143
6.6 Conclusion ............................................................................................................................ 145
6.7 References ............................................................................................................................ 146
6.8 Data supplement ................................................................................................................... 148
7 SUMMARY .......................................................................................................... 152