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Microparticules : de la génération de plasmine à la standardisation d'un biomarqueur émergeant, Microparticles : from plasmin generation to the standardization of an emerging biomarker

De
301 pages
Sous la direction de Françoise Dignat-George
Thèse soutenue le 14 décembre 2010: Aix Marseille 2
Les microparticules (MP) sont des vésicules qui résultent du bourgeonnement des membranesdes cellules activées ou apoptotiques. Leur capacité à vectoriser des systèmes fonctionnelsexprimés par leurs cellules d’origine nous a conduit à explorer, la génération de plasmine àleur surface. Dans un premier travail, nous montrons que les MP dérivées de cellulesendothéliales (MPE) sont des surfaces catalytiques capables d’activer le plasminogène par lesystème de l’urokinase et de son récepteur (uPA/uPAR). Les MPE agissent comme desvecteurs de plasmine constituant une nouvelle voie dans la régulation des activitésprotéolytiques de l’endothélium. Dans un second travail, nous avons montré que l’uPA portéepar les cellules ou par les MPE est spécifiquement impliquée dans un mécanismereconnaissance du plasminogène lié à une autre surface biologique générant de la plasmine insitu avec une grande efficacité. Dans un troisième travail, nous montrons que cette activitéfibrinolytique est détectable sur les MP extraites de la circulation sanguine, où elle est plusspécifiquement portée par les sous populations endothéliales et leucocytaires. Cette activitéqui est dépendante de l’uPA mais aussi de l’activateur tissulaire du plasminogène, estmodulée dans des pathologies cardiovasculaires et auto-immunes. Dans une seconde partie, lapertinence de la mesure des MP comme biomarqueur en pratique clinique nous a amené ànous focaliser sur leurs méthodes d’analyse. En effet, à l’heure actuelle, l’évaluation dubénéfice apporté par les MP est limitée par un manque de standardisation des méthodologies.Dans ce travail, nous présentons une nouvelle stratégie de standardisation de la cytométrie enflux (CMF) et son évaluation dans le cadre d’une étude multicentrique utilisant des microbillesfluorescentes calibrées en taille. Enfin, nous discutons dans une revue les limitesactuelles de la CMF et les stratégies ou améliorations technologiques permettant de lesdépasser.
-Microparticules
-Plasmine
-Fibrinolyse
-Proteolyse
-Standardisation
-Biomarqueur
Microparticles (MP) are small vesicles resulting from the blebbing of cell membranes in response to activation or apoptosis. Because they express functional molecules from their parent cells, plasmin generation at their surface has been explored. First we have shown that endothelial derived MP (EMP) promote plasminogen activation at their surface in an urokinase and its receptor (uPA/uPAR) dependant manner. Thus, plasmin generation by EMP constitutes a new pathway for the regulation of the endothelium proteolytic activities. Second, we have shown that cellular or MP uPA is specifically involved in the recognition and effective activation of plasminogen bound to another biological surface. Third, we have demonstrated that circulating endothelial and leukocytes MP bear this plasminogenolytic activity which it not only uPA but also tissue-type plasminogen activator dependant and modulate in pathological settings such as cardiovascular and auto-immune diseases. Supported by this work, a patent on a method to measure MP plasmin activity has been filed. In a second part, we focused on analytical methods available to measure MP. Indeed, there is an increasing interest to measure MP as biomarker in clinical practice. However, the evaluation of their input for patients is impeding by methodological concerns and a lack of standardization so far. In this work, we present a new strategy based a size-calibrated fluorescent beads for the standardization of flow cytometry (FCM). This approach was evaluated in a multicentre study. Finally, we reviewed the present limitation of the FCM for MP measurement and the strategies or technological improvements to overcome them.
Source: http://www.theses.fr/2010AIX22959/document
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UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE
FACULTE DE PHARMACIE DE MARSEILLE
THESE DE DOCTORAT
Spécialité : Immunologie
Présentée et publiquement soutenue le 14 Décembre 2010
Par M. LACROIX Romaric
Né le 02/11/80 à Toulon
En vue d’obtenir le grade de Docteur de l’Université Aix-Marseille II
---oOo---

TITRE :
MICROPARTICULES : DE LA GENERATION DE PLASMINE A
LA STANDARDISATION D’UN BIOMARQUEUR EMERGEANT.
---oOo---
JURY
Président : M. le Professeur Pierre CAU
Rapporteur : M. le Professeur Jean-Baptiste MICHEL
Rapporteur : M. le Professeur Pierre SIE
Directeur de thèse: Mme le Professeur Françoise DIGNAT-GEORGE
Examinateur : M. Christophe DUBOIS

REMERCIEMENTS


En tête de cette liste, je remercie celle qui a subi avec patience ce travail, ma
chère épouse Damaris avec une tendre pensée pour mes deux petits garçons Siméon et
Noé.
Je remercie mon directeur de thèse, Françoise, pour m’avoir guidé dans ce
travail et pour toute son attention quotidienne.
Je remercie les membres du jury de thèse d’avoir accepté de juger ce travail.
Je remercie le Professeur J. Sampol pour m’avoir acceuilli dans son laboratoire
Je remercie le Professeur L. Camoin-Jau pour m’avoir donné le goût de
l’hématologie.
Je remercie Florence pour son soutien constant.
Je remercie tous ceux avec qui je travaille au quotidien : la microparticule team
(Stephane, Philippe, Coralie et Tarik), Christophe et Laurence, mes partenaires de
bureau (Stephane et Lucas), Corine, mes co-assistantes (Stephanie, Magalie, Elise, Yaël
et Maud), toute l’équipe de séniors et juniors de l’u608 et toute l’équipe de biologistes et
de techniciens du service d’hématologie de la Conception, les secrétaires.
Je remercie ceux qui m’ont acceuilli pendant cette thèse : Eduardo Angles-Cano,
Bruce et Barbara Furie.
Je remercie mes parents et ma sœur Karine
Je remercie mes anciens co-internes : Sofiane, Boris et Anne-Catherine
Je remercie mes amis de toujours : Adrien et Natacha, Titi et Vincent, TomTom
et Pauline, Kalou, Momo, Hélène et Fabien, Betty, TonTon, Marjorie et Franck,
Sandra.
Je remercie ceux qui m’ont guidé : Tonton et Tata, M.Tafani, Guillaume, Père
Host du Roure
Je remercie Dieu



« J’ai appliqué mon cœur à rechercher et à explorer par la
sagesse tout ce qui se fait sous les cieux, c’est une occupation
ingrate que Dieu a donnée aux fils des hommes afin qu’ils s’y
fatiguent »
Ecclésiate 1v 13











SOMMAIRE

REMERCIEMENTS ............................................................ 1
SOMMAIRE ......................................................................... 3
TABLE DES FIGURES ....................................................... 8
PRINCIPALES ABREVIATIONS .................................... 10
PREMIERE PARTIE: REVUE BIBLIOGRAPHIQUE . 12
CHAPITRE 1 : MICROPARTICULES, DEFINITION ET
ORIGINE ............................................................................ 13
A. MICROPARTICULES : ASPECT HISTORIQUE .............................. 13
1) Cellules hématopoïétiques et vasculaires .................................................. 13
2) Cellules tumorales ....................................................................................... 15
3) Autres types cellulaires ............................................................................... 15
B. DEFINITION DES MICROPARTICULES .......................................... 17
1) Définition ...................................................................................................... 17
2) Terminologie ................................................................................................ 17
C. FORMATION DES MICROPARTICULES ......................................... 19
1) Mécanismes de formation des microparticules ........................................ 19
a. Remaniement des phospholipides de la membrane plasmique ............ 20
i. Asymétrie de la membrane plasmique .................................. 20
ii. Activation cellulaire et externalisation de la
phosphatidylsérine .................................................................... 21
iii. Lien entre l’exposition de la PS et la vésiculation cellulaire
.................................................................................................. 22
iv. Limites du modèle actuel ..................................................... 22
v. Autres mécanismes de vésiculation dépendant de la
composition en phospholipides ................................................. 23

b. Réarrangement du cytosquelette ............................................................ 23
i. Rôle des calpaïnes ................................................................. 25
ii. Rôle de la Gelsoline .............................................................. 25
iii. Rôle de l’interaction phospholipides/cytosquelette ............. 25
iv. Mécanismes moléculaires aboutissant au remodelage du
cytosquelette ............................................................................. 26
2) Les inducteurs de la vésiculation .............................................................. 27
a. Activation cellulaire ................................................................................. 28
i. Les plaquettes ........................................................................ 28
ii. Les globules rouges .............................................................. 29
iii. Les leucocytes ...................................................................... 29
iv. Les cellules endothéliales .................................................... 30
b. Apoptose .................................................................................................... 32
c. Conclusion ................................................................................................. 33

CHAPITRE 2 : MICROPARTICULES : STRUCTURE
ET FONCTION .................................................................. 34
A. COMPOSITION DES MICROPARTICULES ..................................... 34
B. FONCTIONS DES MICROPARTICULES ........................................... 36
1) Rôle des microparticules dans l’hémostase ............................................. 36
2) Rôle des microparticules dans la modulation du tonus vasculaire ........ 41
3) Rôle des microparticules dans l’inflammation ......................................... 43
4) Rôle des microparticules dans l’angiogenèse ........................................... 44
5) Rôle des microparticules dans la protéolyse matricielle ......................... 46
6) Rôle des microparticules dans la survie cellulaire .................................. 47
7) Rôle des microparticules dans la modulation de la réponse immunitaire
........................................................................................................................... 48
8) Rôle des microparticules dans la communication intercellulaire ........... 49

CHAPITRE 3 : LA GENERATION DE PLASMINE ..... 51
A. LE PLASMINOGENE ............................................................................. 51
B. LES ACTIVATEURS DU PLASMINOGENE ...................................... 53
1) L’activateur tissulaire du plasminogène (t-PA) ....................................... 53
2) L’urokinase (uPA) ...................................................................................... 55
3) Le récepteur de l’urokinase (uPAR) ........................................................ 56
C. LA FORMATION DE PLASMINE ........................................................ 57
1) Formation de plasmine par le t-PA .......................................................... 57
2) Formation de plasmine par l’uPA ............................................................ 59
D. LA REGULATION DE LA GENERATION DE PLASMINE. ........... 60
1) Les serpines .................................................................................................. 61
2) Les inhibiteurs de liaison du plasminogène ............................................. 65
E. CONSEQUENCES DE L’ACTIVATION DU PLASMINOGENE ..... 66
1) La fibrinolyse ............................................................................................... 66
2) Le remodelage matriciel ............................................................................ 67
3) Autres conséquences de l’activation du plasminogène ............................ 69

CHAPITRE 4 : MICROPARTICULES :
BIOMARQUEUR EN PATHOLOGIE HUMAINE ........ 70
A. INTERET DU DOSAGE DE MICROPARTICULES CIRCULANTES
EN PATHOLOGIE HUMAINE ................................................................... 70
1) Signification biologique des microparticules en pathologie. .................. 70
2) Limites actuelles de l’utilisation des microparticules comme
biomarqueur en pathologie humaine. ............................................................ 77
B. VARIABLES PRE-ANALYTIQUES POUVANT INFLUER SUR LES
DOSAGES DE MICROPARTICULES....................................................... 77
C. METHODOLOGIES DISPONIBLES POUR L’ANALYSE DES
MICROPARTICULES ................................................................................. 80
1) Diversité des méthodologies disponibles pour l’analyse des
microparticules ................................................................................................ 80
2) Avantages et limites des techniques de mesure des microparticules ..... 84
DEUXIEME PARTIE: TRAVAUX PERSONNELS ........ 88
INTRODUCTION ......................................................................................... 88
ARTICLE 1 .................................................................................................... 90
ARTICLE 2 .................................................................................................... 93
ARTICLE 3 .................................................................................................... 96
BREVET 1 ...................................................................................................... 98
ARTICLE 4 .................................................................................................... 99
ARTICLE 5 .................................................................................................. 102
DISCUSSION-PERSPECTIVES ............................................................... 104
ANNEXES .......................................................................... 111
BIBLIOGRAPHIE ............................................................112

Table des figures
Figure 1 : Images historiques de microparticules par microscopie. …………………..16
Figure 2 : Représentation schématique de la libération des différentes microvésicules
par la cellule dans l’espace extracellulaire. ......................................................................... 18
Figure 3 : Implication du cytosquelette dans le mécanisme de vésiculation. ................... 24
Figure 4 : Place de l’activation de ROCK dans le phénomène de vésiculation ............... 27
Figure 5 : Mécanisme de formation des MPE après stimulation par la thrombine ........ 31
Figure 6 : Composition moléculaire fonctionnelle des microparticules endothéliales. ... 35
Figure 7 : Contribution de la génération des MPE à l’activité procoagulante. ............... 39
Figure 8 : Contribution des MP tumorales à la formation du thrombus in vivo ............. 40
Figure 9 : MPE et dysfonction endothéliale par diminution de la synthèse de NO. ....... 42
Figure 10 : Lien entre propriétés pro-thrombotique et inflammatoire des MP. ............. 44
Figure 11 : Augmentation de l’angiogenèse par des concentrations croissantes de MPP
dans un modèle d’anneaux aortiques de rat ........................................................................ 46
Figure 12 : Différents modes d’interaction entre les MP et la cellule cible. ..................... 50
Figure 13 : Structure du plasminogène. ............................................................................... 53
Figure 14 : Structure du t-PA ............................................................................................... 54
Figure 15 : Conversion de pro-urokinase en urokinase par la plasmine .......................... 56
Figure 16 : Formation de plasmine par le t-PA ou l’u-PA à la surface des cellules
endothéliales. .......................................................................................................................... 59
Figure 17 : Inhibiteurs du système fibrinolytique. ............................................................ 60
Figure 18 : Inhibition du complexe u-PA/u-PAR par le PAI-1. ........................................ 62
Figure 19 : Conséquences de la génération de plasmine par le système uPA/uPAR. ...... 68
Figure 20 : Balance définissant la vasculocompétence. (Sabatier F, JCMM 2009) ......... 76
Figure 21 : Etapes du processus pré-analytiques pouvant influer sur le dosage des MP.
.................................................................................................................................................. 80

Figure 22 : Exemple de mesure des MPP par cytométrie de flux ..................................... 81
Figure 23 : Principe d’une méthode hybride combinant capture et test fonctionnel. ..... 83
Figure 24 : Shéma du principe d’un appareil utilisant le single particle tracking .......... 84
Tableau 1 : Caractéristiques différentielles des différentes vésicules. .............................. 19
Tableau 2 : Signification clinique de l’élévation des MPE en pathologie ......................... 73
Tableau 3 : Résumé des principales caractéristiques des techniques utilisées pour la
mesure des MP ....................................................................................................................... 87


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