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Molecular genetic and physiological studies on the sex-determining M-m and A-a genes in cucumber (Cucumis sativus L.) [Elektronische Ressource] / von Diro Terefe

De
146 pages
Molecular Genetic and Physiological Studies on the Sex-determining M/m and A/a Genes in Cucumber (Cucumis sativus L.) von der Naturwissenschaflichen Fakulität der Universität Hannover zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Gartenbauwissenschaften -Dr. rer. hort.- genehmigte Dissertation von Diro Terefe (MSc) geboren am 28.07.1974 in Gedo (Shoa), Äthiopien 2005 Referent: Prof. Dr. Turan Tatlioglu Korreferent: Prof. Dr. Edgar Maiß Tag der Promotion: 27. 06. 2005 Dedicated to my grandfather, the late Beyene Buya Molecular Genetic and Physiological Studies on the Sex-determining M/m and A/a Genes in Cucumber (Cucumis sativus L.) Abstract Sex determination in cucumber is the most extensively studied subject. Three major genes (F/f, M/m and A/a) have been described that control sex in cucumber. In addition to these genes, environmental and hormonal factors also influence the sex in cucumber plants. Because of its direct influence on sex expression ethylene is considered as a sex hormone of cucumber. In relation to the sex hormone ethylene, the assumed role of the sex-determining F/f, M/m and A/a genes is that the F/f gene controls the level of ethylene; the M/m gene influences ethylene perception and signaling and the A/a gene may control the level of ethylene biosynthesis, perception and signaling.
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Molecular Genetic and Physiological Studies
on the Sex-determining M/m and A/a Genes
in Cucumber (Cucumis sativus L.)




von der Naturwissenschaflichen Fakulität
der Universität Hannover
zur Erlangung des akademischen Grades eines


Doktors der Gartenbauwissenschaften
-Dr. rer. hort.-


genehmigte Dissertation


von
Diro Terefe (MSc)
geboren am 28.07.1974 in Gedo (Shoa), Äthiopien


2005





Referent: Prof. Dr. Turan Tatlioglu
Korreferent: Prof. Dr. Edgar Maiß
Tag der Promotion: 27. 06. 2005


















Dedicated to
my grandfather, the late Beyene Buya

Molecular Genetic and Physiological Studies on the Sex-determining M/m
and A/a Genes in Cucumber (Cucumis sativus L.)
Abstract
Sex determination in cucumber is the most extensively studied subject. Three major genes
(F/f, M/m and A/a) have been described that control sex in cucumber. In addition to these
genes, environmental and hormonal factors also influence the sex in cucumber plants.
Because of its direct influence on sex expression ethylene is considered as a sex hormone of
cucumber. In relation to the sex hormone ethylene, the assumed role of the sex-determining
F/f, M/m and A/a genes is that the F/f gene controls the level of ethylene; the M/m gene
influences ethylene perception and signaling and the A/a gene may control the level of
ethylene biosynthesis, perception and signaling. Tremendous achievements have been made
in characterizing the sex-determining F/f gene in relation to ethylene-related genes. In recent
years, characterization using the ethylene synthesis-related genes enabled researchers to
isolate the promoter region of the dominant F gene in cucumber. Only few studies have been
conducted concerning the characterization of the M/m and A/a genes. Most of the previous
investigations were on the F gene, since the amount of ethylene correlates with the F gene
that provided a hint for intensive study on the F gene.
To understand the assumed role of the M/m gene in ethylene perception and signal
transduction, the expression levels of ethylene receptor and ethylene signal transduction
related genes were compared between nearly isogenic cucumber lines that differ on the M/m
gene. Strong expression level of the ethylene receptor genes (CsETR1, CsETR2 and CsERS)
and weak expression levels of the ethylene signal transduction related-genes (CsEIN3 and
CsEIL1) are detected in developed stamen-primordia linked to the recessive m gene of
hermaphrodite cucumber. The exact opposite result is detected in arrested stamen-primordia
ilinked to the dominant M gene in gynoecious cucumber. Further comparison of the expression
level of the ethylene related genes after chemical application indicated that the dominant M
gene in gynoecious controls the expression level of ethylene receptor and signaling genes in a
different way than the recessive m gene in hermaphrodite cucumber. Physiological
investigation also showed that the gynoecious cucumber with the dominant M gene responds
differently than the hermaphrodite cucumber with the recessive m gene towards external
chemical application. Thus, these results indicate that M/m gene control the effect of ethylene
at a level of ethylene perception and signal transduction.
Identical expression level of ethylene receptor and signal transduction-related genes are
detected in flowers and leaves of monoecious and androecious cucumber plants that differ by
the A/a gene. Physiological studies by grafting, and ethylene measurement after chemical
application also revealed that the response from the dominant A gene and the recessive a gene
in relation to the sex hormone ethylene is identical. Therefore, the findings indicate that the
A/a gene may not involve in ethylene perception and signal transduction.
In the attempt to isolate the sex-determining M/m gene, suppression subtractive hybridization
was used on mRNA obtained from nearly isogenic gynoecious and hermaphrodite cucumber
floral buds. 21 cDNA clones were isolated. The sequences of the clone ‘cl-38’ is homologous
to nucleotide sugar epimerase, hence named as putative nucleotide sugar epimerase. This
putative nucleotide sugar epimerase is shown to be poorly expressed in female floral buds
than the male and hermaphrodite floral buds. The weak expression level of the putative
nucleotide sugar epimerase in female floral buds is an indicative that the gene function is
impaired in female flower and cause arrest of the stamen development. The isolated putative
nucleotide sugar epimerase gene may be the product of the sex-determining M/m gene.
iiPreliminary analysis using Southern blot indicated that the copper transporter (CsRAN1) gene
is linked to the sex-determining A/a gene. After further confirmation analyses, this approach
may be used to isolate the sex-determining A/a gene in cucumber.
Key Words: Cucumber, Ethylene, Sex determination
iiiMolekular genetische und physiologische Studien an geschlechts-
bestimmenden M/m und A/a- Genen der Gurke (Cucumis sativus L.)
Zusammenfassung
Geschlechtsdetermination ist einer der am häufigsten untersuchten Eigenschaften bei der
Gurke. Drei Majorgene F/f, M/m und A/a sind beschrieben worden, die das Geschlecht dieser
Pflanzenart kontrollieren. Zusätzlich zu diesen Genen beeinflussen noch hormonale Faktoren
und Umweltfaktoren das Geschlecht der Gurke. Wegen seines direkten Einflusses auf die
Geschlechtsexpression der Gurke wird Ethylen als Geschlechtshormon der Gurke betrachtet.
Die bisherige Vorstellung bzw. Annahme bezüglich der Bedeutung der
geschlechtsbestimmenden Gene F/f, M/m und A/a im Zusammenhang mit dem Ethylen kann
wie folgt beschrieben werden: Das Gen F/f kontrolliert die Ethylenproduktion , das M/m Gen
könnte die Ethylenperception und/oder -transduktion kontrollieren, und das A/a Gen könnte
an der Ethylenbiosynthese und/oder -perception und/oder –transduktion beteiligt sein. Es sind
bezüglich der Charakterisierung des F/f Gens im Zusammenhang mit den Genen, die mit dem
Ethylen in Beziehung stehen, wichtige Aussagen gemacht worden. In den letzten Jahren hat
z.B. die Nutzung der Charackterisierung der mit der Ethylenbiosynthese in Beziehung
stehenden Genen den Forschern die Isolierung der Promotorregion des dominanten F Gens
bei der Gurke ermöglicht. Bezüglich der Charakterisierung der M/m und A/a Gene existieren
jedoch nur sehr wenige Untersuchungen. Dies liegt daran, dass die Korrelation der
Ethylenmenge mit dem F/f Gen im Gegensatz zu den anderen Genen eine gute
Ansatmöglichkeit für die Untersuchungen bietet.
Um die Vorstellung bezüglich der Rolle des M/m Gens in der Ethylenperception und -signal
transduktion zu klären, wurde die Expression der Gene, die zu Ethylenperception und -
signaltransduktion in Beziehung stehen, bei nahe isogenen Gurkenlinien untersucht, die sich
ivnur am M/m Gen unterschieden. An den entwickelten Stamen-Primordia der mit dem
rezessiven m Gen in Verbindung stehenden hermaphroditischen Pflanzen konnte eine
wesentlich stärkere Expression der Ethylenrezeptorgene CsETR1, CsETR2 und CsERS und
eine wesentlich schwächere Expression der Ethylensignaltransduktionsgene CsEIN3 und
CsEIL1 festgestellt werden. Dagegen wurden an den in ihrer Entwicklung verhinderten
Stamen-Primordia der mit dem dominanten M Gen in Verbindung stehenden gynözischen
Pflanzen genau entgegengestzte Ergebnisse erzielt. Weiterer Vergleich der Expression der zur
Ethylen in Beziehung stehenden Gene nach Verabreichung von Chemikalien zeigte, dass das
dominante M Gen der gynözischen Pflanzen die Expression der Ethylenrezeptorgene und -
signaltransduktionsgene auf einer anderen Art und Weise beeinflußt als das rezessive m Gen
der hermaphroditischen Pflanzen. Auch bei physiologischen Studien zeigten die gynözischen
Pflanzen mit dem dominanten M Gen gegenüber der Behandlung mit Chemikalien eine völlig
andere Reaktion als die hermaphroditischen Pflanzen mit dem rezessiven m Gen. Diese
Ergebnisse zeigen, dass das M/m Gen den Effekt des Ethylens auf der Ebene der Ethylenper-
ception und Ethylensignaltransduktion kontrolliert.
Identische Expression der Gene, die mit der Ethylenperception und -signaltransduktion in
Beziehung stehen, wurden bei den monözischen und andrözischen Pflanzen, die sich am A/a
Gen unterscheiden, sowohl in den Blüten als auch in den Blättern festgestellt. Physiologische
Studien nach Propfung und Ethylenmessungen nach Behandlung mit Chemikalien zeigten,
dass die Reaktion des dominanten A Gens und des rezessiven a Gens bezüglich der
Beziehung zu dem Geschlechtshormon Ethylen identisch ist. Diese Ergebnisse deuten darauf
hin, dass das A/a Gen in Ethylenperception und Ethylensignaltransduktion höchstwahrscheinl-
ich nicht involviert ist.
Bei den Versuchen, deren Ziel die Isolierung des Gens M/m war, wurde an mRNA aus
Blütenknospen der nahe isogenen gynözischen und hermaphroditischen Linien die
v„Supression Subtractive Hybridisation“ Methode angewandt. 21 cDNA Klone wurde isoliert.
Es wurde gezeigt, dass der Klon ‚cl-38’, der nach Sequenzanalysen als „putative
nucleotide sugar epimerase“ bezeichnet wurde, in weiblichen Blütenknospen wesentlich
schwächer expremiert wird als in Knospen der männlichen und hermaphroditischen Blüten.
Dies deutet darauf hin, dass dieses Gen an der Verhinderung des Stamenentwicklung der
weiblichen Blüten involviert ist. Das isolierte „putative nucleotide sugar epimerase“ könnte
das Produkt des M/m Gens sein.
Vorläufige Analysen durch die Nutzung der Southern Blot- Technik deuten darauf hin, dass
das Kupfer Transporter Gen CsRAN1 mit dem Gen A/a gekoppelt ist. Die Bestätigung dieses
Ergebnisses könnte für die Isolierung des A/a Gens einen wichtigen Ansatzpunk bedeuten.
Schlüsselwörter: Gurke, Ethylen, Geschlechtsdetermination
viTable of Contents
Abstract...................................................................................................................................... i
Zusammenfassung................................................................................................................... iv
Table of Contents ...................................................................................................................vii
Abbreviations............................................................................................................................ x
1 General Introduction ............................................................................................................ 1
2 Molecular genetic characterizations of the sex-determining M/m and A/a genes by
using ethylene receptor and signal transduction-related genes in cucumber ................. 9
2.1 Introduction .................................................................................................................... 9
2.2 Materials and Methods ................................................................................................ 12
2.2.1 Plant materials 12
2.2.2 Growing of experimental plants.............................................................................. 13
2.2.3 Chemical application at 4 leaf-stage on gynoecious and hermaphrodite
cucumbers 14
2.2.4 RNA isolation.......................................................................................................... 14
2.2.5 DNA isolation ......................................................................................................... 15
2.2.6 Preparation of ethylene receptor and signal transduction-related genes ................. 17
2.2.7 Northern blot hybridization analyses using ethylene receptor and signal
transduction-related genes ...................................................................................... 21
2.2.8 Semi-quantitative RT-PCR analyses using ethylene receptor and signal 23
2.2.9 Southern blot hybridization analyses using ethylene receptor and signal
transduction-related genes 24
2.3 Results ........................................................................................................................... 26
2.3.1 Influence of the sex-determining M/m gene on the expression level of ethylene
receptor and signal transduction-related genes....................................................... 26
2.3.2 Influence of the sex-determining M/m
receptor and signal transduction-related genes after chemical applications........... 28
2.3.3 Influence of the sex-determining A/a
receptor and signal transduction-related genes....................................................... 32
2.3.4 Southern blot hybridization..................................................................................... 33
2.4 Discussion...................................................................................................................... 35
vii

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