NoRC, a novel chromatin remodeling complex involved in ribosomal RNA gene silencing [Elektronische Ressource] / Ralf Strohner

Strohner, Ralf

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• Publié par: ludwig-maximilians-universitat_munchen
• Publié le: 01 janvier 2004
• Nombre de lectures: 36
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 11 Mo

Extrait

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Ludwig-Maximilians-Universität München
NoRC,
a novel chromatin remodeling complex
involved in
ribosomal RNA gene silencing
Ralf Strohner
aus
Weinheim
2004Erklärung
Diese Dissertation wurde im Sinne von § 13 Abs. 3 bzw. 4 der Promotionsordung vom 29.
Januar 1998 von Prof. Dr. P.B. Becker betreut. Die Fachvertretung übernahm freundlicherweise
PD Dr. M. Meisterernst.
Ehrenwörtliche Versicherung
Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.
München, 16.09.2004
Ralf Strohner
Dissertation eingereicht am: 16.09.2004
1. Gutachter: Prof. Dr. Peter B. Becker
2. Gutachter: PD Dr. Michael Meisterernst
Mündliche Prüfung am: 19.11.2004ACKNOWLEDGMENTS / DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt meinem Betreuer PD Dr. Gernot Längst für die Vergabe dieser Arbeit, die
vielfältigen Anregungen, all die Freiheiten, die fachliche Betreuung sowie die motivierenden Pro &
Contra Diskussionen. Vielen Dank für diese wunderbare Zeit in Deiner Obhut.
Ich bin und bleib der erste !
Gleicherweise möchte ich mich bei Prof. Peter B. Becker für die Bereitstellung der Arbeitsmittel, die sehr
angenehmen Atmosphäre überall im Institut, die ausgezeichneten Betreuung und die Förderung dieser
Arbeit bedanken.
Herrn PD Dr. Michael Meisterernst möchte ich für die bereitwillige Übernahme des Zweitgutachtens und
der Fachvertretung vor der chemischen Fakultät herzlichst danken.
Für die gute Zusammenarbeit, den Austausch von unpublizierten Daten und die Bereitstellung zahlreicher
Reagenzien bedanke ich mich bei Prof. Dr. Ingrid Grummt und den Mitgliedern ihrer Arbeitsgruppe.
I want to thank Dr. Karl Nightingale for kindly providing the recombinant histone octamers, Prof. R.E.
Kingston for the Snf2h clone and Prof. R. Shiekhattar for the Snf2h KR211 clone. Dr. Anton Eberharter
und Prof. Peter Becker danke ich für die großzügige Bereitstellung der Abildung ’ATP-dependent
nucleosome remodeling factors’.
Ein besonderes Dankeschön richtet sich an die Mitarbeiter der LÄNGST-GRUPPE: Attila Németh, Julia
Hochstatter, Karoline Dachauer und Anna Schrader für das angenehme Arbeitsklima, den vielen
motivierenden Diskussionen, den freien Austausch von Reagenzien und Lösungen und die Toleranz bei
der Musikauswahl. Ein spezieller Dank an Attila für all die schönen passiven Fußball Erinnerungen.
I want to thank all present and former lab members for the nice, relaxed and productive lab environment.
Without all the reagents, ideas, comments and cakes this thesis would have not been possible.
Thanks to Karim Bouazoune, Gregor Gilfillan, Tobias Straub, Josephine Sutcliffe, Anton Eberharter,
Michael Korenjak, Irene Vetter, Daisy Schwarzlose, Felix Hartlepp, Nina Izzo, Catherine Regnard, Roger
Ferreira, Tiziana Bonaldi, Birgit Czermin, Philipp Greif, Ina Dhalsveen, Rosmarie, Asifa Akhtar,
Gabrielle Mengus, Jörn Boeke, Ragnhild, Martin, Jörg, Matthias, Violetta Morales, Rein Aasland, Heike
Mittlöhner, Carin von Oberkamp, Cristina Chioda, Gustav Klobeck, Wolfram Hoerz’ lab, Ralph Rupp’s
lab, Janek Brzeski, Angelika Mitterweger, Axel Imhof and Alexander Brehm.
Irene Vetter danke ich für die Hilfe beim Sequenzieren, Klonieren und fürs Ratschen; Christina ’Daisy’
Schwarzlose für all die Hilfe und Arbeitsabnahme in der Zellkultur. I’m grateful to Karim Bouazoune for
all the Mi-2 preps (pure upper band), the ‘perfect introduction’, all the nice discussions and switching off
the light and closing all the doors every day. Ich danke Anton Eberharter für die stete Bereitschaft zum
Austausch von ISWI, ACF und Nukleosomen. Mein Dank gilt Felix Hartlepp für die cruziforme DNA,
3 Alexander Brehm für die H-acetylierten Histone, Axel Imhof für die Hilfe mit den ÄKTA’s, Tobias
Straub für all die medizinischen und computer-technischen Auskünfte, Birgit Czermin für ihre nützlichen
Vorschläge zur Doktorarbeit und Hans Reinke fürs ‘Zötteln’.Für das Korrekturlesen dieser Arbeit und allen positiven Verbesserungsvorschlägen bedanke ich mich
herzlichst bei Gernot, Attila, Julia und Nikky. I’m in debt to Josephine Sutcliffe for her help with the
language corrections. Thanks a lot! Thanks to Gregor for the last minute corrections.
Isabell Defièbre und Herrn Karadede danke ich herzlich für die Unterstützung beim Druck dieser Arbeit.
An dieser Stelle möchte ich mich ganz besonders bei meinen Geschwistern Thomas, Marcus, Joachim,
Stefanie und Regina mit all ihren Anhängen (Kathrin, Lilly, Isabelle, Anne, Marco und Caesar) und
meinen Eltern für die großartige Unterstützung während meiner Doktorarbeit bedanken. Meinem kleinen
Bruder danke ich für all die motivierenden Besuche, Telefonate und Mp3s: Ohne Dich hätte die
Doktorarbeit nur halb so gerockt.
Danke auch an alle außerhalb der Wissenschaft, die mir die Doktorandenzeit versüßt haben. Ein
besonderer Dank an Sonia fürs Anquatschen von der Seite und damit der Möglichkeit zur großartigsten
Entdeckung während dieser Doktorarbeit.
Mein liebster Dank geht an Nikky für all ihre liebevolle Hilfe und ihr Verständnis.
In Gedenken an Caecilie Olbricht. TABLE OF CONTENT
TABLE OF CONTENT
1F IGURE INDEX 5
2T ABLE INDEX 6
3L IST OF ABBREVIATIONS 7
4S UMMARY 9
4.1 NoRC, a novel chromatin remodeling complex 9
4.2 NoRC specifically represses rDNA transcription in chromatin 10
5I NTRODUCTION 11
5.1 Chromatin structure 11
5.1.1 The nucleosome is the basic unit of chromatin 11
5.1.2 From nucleosome core particle to higher order structures of chromatin 12
5.1.3 ‘Chromatin territories’ (eu- and heterochromatin) 13
5.2 Posttranslational modifications of histones 14
5.2.1 Histone acetylation 15
5.2.2 Histone methylation 17
5.2.3 Other covalent histone modifications 18
5.3 Histone variants 19
5.4 Chromatin assembly 19
5.5 ATP-dependent nucleosome remodeling 20
5.5.1 The Swi/Snf family of remodeling machines 21
5.5.2 The ISWI family of nucleosome remodeling complexes 23
5.5.2.1 Biochemical properties of ISWI-containing remodeling complexes 27
5.5.3 The CHD / Mi-2 class of chromatin remodeling factors 28
5.5.4 The Ino80 group 28
5.5.5 Possible mechanism of nucleosome remodeling 29
5.6 Ribosomal RNA gene regulation 31
5.6.1 The nucleolus, the site of rRNA gene transcription and ribosome biogenesis 31
5.6.2 The organization of mammalian ribosomal RNA genes 32
5.6.3 Regulation of ribosomal RNA transcription 33
5.6.4 Termination of rDNA transcription 35
5.6.5 The transcription termination factor TTF-I 35
5.6.6 The role of TTF-I at the rDNA promoter 36
5.6.7 Chromatin structure of ribosomal RNA genes 37
5.6.8 Silencing of ribosomal RNA genes 39
5.7 Tip5, subunit of a nucleolar remodeling complex? 40
6O BJECTIVES 43
6.1 Ribosomal RNA gene regulation in chromatin 43
6.2 Purification of a Tip5 complex and analysis of its role in rDNA transcription 43
1TABLE OF CONTENT
7M ATERIALS AND METHODS 45
7.1 Materials 45
7.1.1 Chemicals, radioactive material, enzymes, chromatographic material 45
7.1.1.1 Enzymes 45
7.1.1.2 Chromatographic material 45
7.1.1.3 Blotting materials 45
7.1.1.4 Dialysis and filtration materials 45
7.1.2 Standard solutions 46
7.1.3 Antibodies 47
7.1.4 Plasmids 47
7.1.5 Recombinant baculo viruses 48
7.1.6 Oligonucleotides within the mouse rDNA promoter 49
7.1.7 Bacteria, cells & cell extracts 49
7.1.8 Drosophila melanogaster: maintenance, embryo collection and extracts 50
7.1.9 Recombinant histones 50
7.2 Methods 50
7.2.1 Working with DNA: standard procedures 50
7.2.1.1 Radioactive labeling of DNA 50
7.2.1.2 Precipitation and isolation of radioactive DNA fragments 50
7.2.1.3 Annealing of double stranded oligonucleotides 51
7.2.1.4 DNA methylation 51
7.2.2 Protein analysis: standard procedures 51
7.2.2.1 Determination of protein concentrations 51
7.2.2.2 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 51
7.2.2.3 Coomassie blue staining of protein gels 52
7.2.2.4 Silver staining of protein gels 52
7.2.2.5 Silver staining of histones 52
7.2.2.6 Semi dry Western analysis 52
7.2.2.7 Wet Blot Western analysis 53
7.2.3 Purification of cellular Tip5-Snf2h complex (NoRC) 53
7.2.4 Expression of recombinant proteins with the baculo virus system 54
7.2.4.1 Construction of recombinant baculo viruses 54
7.2.4.2 Virus amplification 54
7.2.4.3 Infection of insect cells and expression of recombinant proteins 54
7.2.4.4 Culturing of Sf9 cells 55
7.2.5 Purification of recombinant proteins 55
7.2.5.1 Purification of Histidine-tagged TTF-I (two steps) 55
7.2.5.2 Purification of Snf2h, ISWI, Acf1 and ACF (via Flag-tag) 56
7.2.5.3 Purification of recombinant NoRC (two steps) 57
7.2.5.4 Purification of recombinant Myc-tagged Tip5 (two steps) 58
7.2.6 Superose 6 gelfiltration of recombinant proteins 58
7.2.7 Protein - protein interaction assay (‘Pull-down’ assay) 58
7.2.8 Chromatin – preparation of histone octamers 59
7.2.8.1 Expression and purification of rec