On the role of Wt1, Dmrt8 and Sox9 during murine gonad development and sex determination [Elektronische Ressource] / von Jürgen Thomas Klattig

Juergen Gulbins

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• Biologie

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• Publié par: friedrich-schiller-universitat_jena
• Publié le: 01 janvier 2006
• Nombre de lectures: 37
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 5 Mo

Extrait

On the role of Wt1, Dmrt8 and Sox9
during murine gonad development
and sex determination





Dissertation


zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)




vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena





von
Diplombiologe Jürgen Thomas Klattig

geboren am 27.01.1975
in Garmisch-Partenkirchen






































Gutachter:
1. Prof. Dr. Christoph Englert
2. Prof. Dr. Manfred Schartl
3. Prof. Dr. Aria Baniahmad
Tag des Rigorosums: 07.03.2006
Tag der öffentlichen Verteidigung: 28.03.2006


Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ist es ein Mädchen oder ein Junge? Das ist wohl immer die erste Frage, die jeden
interessiert, wenn ein Kind geboren wird. Leider gibt es verschiedene menschliche
Krankheiten, die dazu führen, dass diese Frage nicht immer ganz leicht zu
beantworten ist. Hervorgerufen werden diese Krankheiten durch Mutationen in
verschiedenen Genen, die eine Rolle bei der Entwicklung der primären
Geschlechtsorgane (Gonaden) spielen. So können Patienten mit bestimmten
Mutationen in den Genen Wt1, Dmrt1 oder Sox9 Merkmale beider Geschlechter
besitzen. Alle diese Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren.
Wt1 spielt eine fundamentale Rolle in der Entwicklung der Gonaden in beiden
Geschlechtern. Mäuseembryonen ohne ein funktionsfähiges Wt1 Gen beginnen zwar
Gonaden zu entwickeln, verlieren diese aber im Laufe ihrer weiteren Entwicklung
wieder. Welche Funktion das Wt1 Protein im Detail hat und welche Gene durch Wt1
reguliert werden ist noch immer weitgehend unverstanden. Im Rahmen dieser Arbeit
+/+wurde versucht, durch Vergleich der Genexpression in den Gonaden von Wt1 und
-/-Wt1 Mäuseembryonen neue Zielgene von Wt1 zu identifizieren. Dadurch konnte
gezeigt werden, dass die Expression des Gens AmhrII, das eine wichtige Rolle in der
männlichen Geschlechtsdifferenzierung spielt, von Wt1 abhängt. Weitere
Untersuchungen haben ergeben, dass Wt1 den Promoter dieses Gens direkt bindet
und aktiviert.
Die Dmrt-Gene gehören zur bisher einzigen bekannten Genfamilie, die für die
Geschlechtsbestimmung verschiedener Tierstämme (z.B. Würmer, Fliegen und
Wirbeltiere) wichtig ist. In mehreren Wirbeltieren scheint vor allem Dmrt1 eine
wichtige Rolle zu spielen. Dmrt1-Knockout-Mäuse zeigen allerdings nur einen
schwachen Phänotyp. Deshalb wird vermutet, dass in Mäusen auch andere Dmrt-
Gene für die Gonadenentwicklung wichtig sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das
Expressionsmuster eines bisher wenig untersuchten Gens – Dmrt8 – analysiert, das
in der Maus in drei Kopien vorkommt. Es stellte sich heraus, dass zwei dieser drei
Kopien ein Expressionsmuster zeigen, das für eine Funktion in den männlichen
Gonaden bzw. deren Entwicklung spricht.
Kollaborationspartnern ist es kürzlich gelungen, eine gonadenspezifische Knockout-
Maus von Sox9 zu erzeugen. Die in dieser Arbeit präsentierte Analyse der
Genexpression in diesem Mausmodel zeigte, dass das Fehlen von Sox9 zu einer
I Zusammenfassung
kompletten Geschlechtsumkehr in genetisch männlichen Embryonen führt. In sich
entwickelnden Gonaden von Sox9-defizienten männlichen Embryonen ist das Gen
Foxl2, das normalerweise nur in weiblichen Gonaden exprimiert wird, aktiviert. Das
spezifisch männliche Gen Amh wird dagegen, trotz Expression des
geschlechtsbestimmenden Gens Sry, nicht aktiviert. Somit scheint nicht Sry, sondern
Sox9 das zentrale Gen für die männliche Geschlechtsentwicklung zu sein. Weiter
wurde Prostaglandin-D-synthase (Ptgds) als potentielles Zielgen von Sox9
identifiziert.

II Abstract

Abstract
Is it a girl or a boy? This is the first question everybody is interested in, when a baby
is born. Unfortunately there are several human diseases, which complicate the
answer to this question. These diseases are caused by mutations in genes, which
play a role in the development of the primary sexual organs (gonads). Patients with
certain mutations in the genes Wt1, Dmrt1 or Sox9, for example, show sexual
ambiguity. All these genes code for transcription factors.
Wt1 plays a fundamental role in the development of gonads of both sexes. Mouse
embryos without an intact Wt1 gene start to develop gonads but lose them again
during further development. The detailed function of Wt1 protein and which genes
are regulated by Wt1 is still quite unknown. Aim of this work was to identify new Wt1
+/+ -/-target genes by comparison of gene expression in Wt1 and Wt1 embryos. It could
be shown that AmhrII, a gene known to be important for male differentiation, depends
on Wt1. Further experiments demonstrated that Wt1 directly binds and activates the
promoter of this gene.
The Dmrt-genes belong to the only gene family known so far, which is important for
sex determination in different metazoan phyla (e.g. worms, flies and vertebrates).
Especially Dmrt1 seems to play an important role in several vertebrates. However,
the phenotype of Dmrt1 knock-out mice is unexpectedly mild. Therefore it has been
speculated that additional Dmrt-genes play a role in murine gonad development. In
this work the expression pattern of Dmrt8, a relatively unexplored gene, of which
three copies can be found in mice, was investigated. It was found, that two of these
three copies show an expression pattern that suggests a role in male gonadal
function and development.
Recently collaboration partners generated a gonad specific Sox9 knock-out mouse.
The analysis of gene expression in this mouse model, presented here, showed that
the lack of Sox9 leads to a complete male-to-female sex reversal. In developing Sox9
mutant male gonads the female-specific gene Foxl2 is upregulated. In contrast, the
male-specific gene Amh is not activated although the sex determining gene Sry is
expressed. Thus, not Sry, but Sox9 seems to be the master sex determining factor.
In addition Prostaglandin D synthase (Ptgds) was identified as a potential target of
Sox9.

III Parts of this work have been published in:

Fischer A, Klattig J, Kneitz B, Diez H, Maier M, Holtmann B, Englert C, Gessler M.
Hey basic helix-loop-helix transcription factors are repressors of GATA4 and
GATA6 and restrict expression of the GATA target gene ANF in fetal hearts.
Mol Cell Biol 2005; 25: 8960-8970.
Barrionuevo F, Bagheri-Fam S, Klattig J, Kist R, Taketo MM, Englert C, Scherer G.
Homozygous Inactivation of Sox9 Causes Complete XY Sex Reversal in Mice.
Biol Reprod 2006; 74: 195-201.
*Veith AM , Klattig J*, Dettai A, Schmidt C, Englert C, Volff JN. Male-biased
expression of X-chromosomal DM domain-less Dmrt8 genes in the mouse.
*Genomics 2006; in press. These authors contributed equally to this work.
Table of Contents

Table of Contents
ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................................. I
ABSTRACT............................................................................................................... III
TABLE OF CONTENTS............................................................................................. V
1 INTRODUCTION................................................................................................. 1
1.1 GONAD DEVELOPMENT .................................................................................... 1
1.2 SEX DETERMINATION AND SOX9....................................................................... 2
1.3 WT1 .............................................................................................................. 6
1.4 DMRT8 ........................................................................................................ 10
1.5 AIM OF THIS WORK ........................................................................................ 11
2 MATERIALS AND METHODS.......................................................................... 12
2.1 MATERIALS .................................................................................................. 12
2.1.1 Oligonucleotides ..................................................................................... 12
2.1.2 Plasmids ................................................................................................. 12
2.1.3 Antibodies............................................................................................