Proteomic and metabolomic analysis of manganese toxicity and tolerance in Vigna unguiculata L. [Elektronische Ressource] / von Hendrik Führs

Hendrik Führs

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• Publié par: gottfried_wilhelm_leibniz_universitat_hannover
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 83
• Langue: Deutsch
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Extrait

Proteomic and Metabolomic
Analysis of Manganese Toxicity and
Tolerance in Vigna unguiculata L.




Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover
zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
genehmigte Dissertation
von
Dipl.-Ing. agr. Hendrik Führs
geboren am 10. März 1978 in Papenburg

2009

































Referent: Prof. Dr. Walter Johannes Horst, Leibniz Universität Hannover
Korreferent: Prof. Dr. Hans-Peter Braun, Leibniz Universität Hannover t: Dr. Joachim Kopka, Max-Planck-Institut für Molekulare
Pflanzenphysiologie
Tag der Promotion: 18 Februar 2009
ii






MEINER MUTTER UND MEINEM BRUDER
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mangantoxizität äußert sich in Cowpea (Vigna unguiculata L.) in Form von braunen Punkten auf den Blättern,
die durch apoplastische Ablagerungen von oxidierten Phenolen und Mn-Oxiden erzeugt werden. Die
Reaktionen, die zur Bildung von braunen Punkten führen, werden auf eine erhöhte Aktivität von apoplastischen
Peroxidasen (EC 1.11.17) zurückgeführt. Es kann davon ausgegangen werden, dass der Symplast modulierend
auf apoplastische Reaktionen, die zur Ausbildung von Mn Toxizität führen, einwirkt. Ziel dieser Arbeit war es
mittels proteomischer und metabolomischer Untersuchungen, Mangan- und Silizium induzierte Veränderungen
im Apoplasten und Symplasten zu charakterisieren, die ursächlich für Mn-Toleranz oder Mn-Sensitivität sind.
Folgende zentrale Ergebnisse wurden erzielt:
(i) Ein erhöhtes Mn-Angebot von nur einem Tag führte bereits zu einer verstärkten Synthese von apoplastischen
Peroxidasen, aber auch von Proteinen, die in der Signaltransduktion und der Zellwandmodifizierung beteiligt
sind. Ein längerfristig erhöhtes Mn-Angebot führte zu symplastischen proteomischen Veränderungen, die sich in
drei physiologische Hauptklassen einteilen lassen: die Photosynthese, eine generelle Stressantwort und
Proteinabbau. Die intensivste Reaktion zeigte dabei die Photosynthese durch eine Mn-induzierte State transition,
eine reduzierte Elektronentransportrate und eine Runterregulation von Enzymen des Calvin Zyklus. Den
Chloroplasten wird daher eine besondere Bedeutung in der Entwicklung von Mn Toxizität zugeschrieben.
(ii) Gelelektrophoretisch aufgetrennte Peroxidase-Isoenzyme zeigten sowohl H O -verbrauchende Guaiacol-2 2
O -bildende NADH-Peroxidase Aktivität, beide jedoch mit verschiedenen pH Peroxidase Aktivität als auch H2 2
Optima. Die Charakterisierung der Substratspezifität der als entscheidend für die apoplastische Ausprägung von
Mn-Toxizität angesehenen NADH-Peroxidase Aktivität zeigte, dass spezifische Phenole allein oder in
Kombination die spezifische NADH-Peroxidase Aktivität fördern oder hemmen. Es konnten im Blattapoplasten
fünf Phenole identifiziert werden, die in-vitro die NADH-Peroxidase Aktivität unterschiedlich beeinflusst hatten.
Die durch Mn-Überschuß und durch Mn-Toleranz erhöhendes Si-Angebot induzierten Unterschiede im Gehalt
an diesen Phenolen im Blattapoplasten unterstützen die Hypothese, dass die apoplastische NADH-Peroxidase
Aktivität und die Modulation ihrer Aktivität durch Phenole eine entscheidende Rolle in der Ausprägung von Mn
Toxizität spielen. Diese wesentliche Rolle von apoplastischen Peroxidasen und ihrer Modulation durch Phenole
bestätigte sich auch für genotypische Mn Toleranz.
(iii) Untersuchungen der Reaktion des Gesamtblatt Metaboloms sowie des apoplastischen wasserlöslichen und
ionisch-gebundenen Metaboloms auf Mn-Überschuß mit und ohne Si-Angebot bei zwei unterschiedlich Mn-
toleranten Genotypen zeigten deutliche behandlungsbedingte Unterschiede. Ein mit statistischen Verfahren
durchgeführtes Screening auf relevante Metabolite erlaubte eine erste Übersicht über die involvierten
biochemischen Pfade. Ein veränderter Zuckermetabolismus wurde sowohl auf eine veränderte Photosynthese als
auch auf einen erhöhten Bedarf an Energie für eine Stressantwort zurückgeführt. Organische Säuren könnten als
Radikalfänger oder auch als Komplexoren für Mn Spezies beginnende Mn Toxizität beschleunigen oder Mn
Toleranz fördern. Veränderungen im Aminosäurepool werden hauptsächlich auf eine verminderte
Nitratassimilationsleistung aufgrund zyklischen Elektronentransportes durch State transitions zurückgeführt. Der
Veränderung von an der Signaltransduktion beteiligten Metaboliten wird eine Rolle in der Stresswahrnehmung
und Übermittlung zugeschrieben und damit als primäre Antwort auf ein erhöhtes Mn und Si Angebot betrachtet.
Zusammenfassend bestätigten die systembiologischen Untersuchungen sowohl den essentiellen Beitrag des
Apoplasten als auch des Symplasten zu Mn-Sensitivität, Si-vermittelter und genotypischer Mn-Toleranz.
Schlagworte: Apoplast, Peroxidase, Silizium
iv Abstract
Abstract
Manganese toxicity in cowpea (Vigna unguiculata L.) is expressed in form of brown spots on the leaves which
are formed by apoplastic depositions of oxidized phenols and Mn-oxides. The reactions leading to the formation
of brown spots are ascribed to an increased activity of apoplastic peroxidases (EC 1.11.17). However, it can be
assumed that the symplast modulates apoplastic responses which lead to the formation of brown spots. The aim
of this study was to characterize by means of proteomic and metabolomic approaches manganese and silicon-
induced changes in the apoplast and symplast which are causative for Mn tolerance or Mn sensitivity. The
following central results have been obtained:
(i) An increased Mn supply for only one day led to an increased synthesis of apoplastic peroxidases, but also of
proteins involved in signal transduction and cell wall modification processes. Longer-termed Mn supply led to
symplastic proteomic changes which can be grouped into three physiological main classes: photosynthesis,
general stress response, and protein degradation. The most intense reaction was observed in the photosynthesis
through Mn-induced state transitions, a reduced electron transport rate, and a down-regulation of enzymes of the
Calvin cycle. Therefore, a special importance of the chloroplasts in the development of Mn toxicity is indicated.
(ii) Peroxidase isoenzymes separated by electrophoresis performed both the H O-consuming guaiacol-2 2
peroxidase activity and the H O -producing NADH-peroxidase activity, however, with different pH optima. The 2 2
characterization of the substrate specificity of the NADH-peroxidase activity which is supposed to be decisive
for the expression of apoplastic Mn toxicity showed that specific phenols alone or in combination enhance or
inhibit the specific NADH-peroxidase activity. Five phenols have been identified in the leaf apoplast which had
differentially affected the in-vitro NADH-peroxidase activity. The excess Mn and Mn-tolerance enhancing Si
supply induced changes of these phenol contents supported the hypothesis that the apoplastic NADH-peroxidase
activity and the modulation of its activity by phenols play a decisive role in the expression of Mn toxicity. This
essential role of apoplastic peroxidases and their modulation by phenols was also proven for genotypic
differences in Mn tolerance.
(iii) Investigations of changes in the bulk-leaf metabolome and the water-soluble and ionically-bound apoplastic
metabolome in response to excess Mn with and without Si supply in two genotypes differing in Mn tolerance
showed clear treatment-dependent differences. Using statistical methods to screen for relevant metabolites
allowed a first overview over involved biochemical pathways. A changed sugar metabolism was not only
reduced to changed photosynthesis but also to an increased demand for energy for a stress response. Organic
acids as scavengers of oxygen radicals or as chelators of Mn species could accelerate Mn toxicity or confer Mn
tolerance. Changes in the amino acid pool have been primarily attributed to a decreased nitrate assimilation due
to cyclic electron transport as a consequence of state transitions. The changes of metabolites involved in signal
transduction have been attributed a role in stress sensing and response and are, therefore, regarded as primary
response to an increased Mn and Si supply.
In sum the “systems biology” approach confirmed the essential contribution not only of the apoplast but also of
the symplast to Mn sensitivity, Si-mediated and genotypic Mn tolerance.
Keywords: apoplast,