Radiobiological experiments for carbon ion prostate cancer therapy [Elektronische Ressource] : interplay of normal and tumor cells in co-culture and measurement of the oxygen enhancement ratio / von Cläre von Neubeck

Description

GSI Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung GmbHTechnische Universität DarmstadtRadiobiological experiments for carbon ionprostate cancer therapy: Interplay of normaland tumor cells in co-culture and measurementof the oxygen enhancement ratioVom Fachbereich Biologie der Technischen Universität DarmstadtzurErlangung des akademischen Gradeseines Doctor rerum naturaliumgenehmigte Dissertation vonDipl.-Ing. Biotechnologie Cläre von Neubeckaus Frankfurt (Main)1. Referent: Prof. Dr. Gerhard Thiel2. Prof. Dr. KraftTag der Einreichung: 31.07.2009Tag der mündlichen Prüfung: 28.09.2009Darmstadt 2009D17ZusammenfassungCo-Kultur Systeme sind häufig ein geeignetes Modell um die Reaktion von Gewebenin vitro zu untersuchen, die bei einer Strahlentherapie notwendigerweise gleichzeitig alsZiel- und Nachbarvolumen exponiert werden. In dieser Arbeit wurde ein Co-Kultur Mod-ell auf Basis von Rattenzellen eines Prostatakarzinoms (Dunning R-3327-AT-1) und desDünndarmepithels entwickelt um die Bestrahlungssituation eines Prostatakarzinompa-tienten zu simulieren. Beide Zelllinien wurden in Mono-Kulturen auf ihre Strahlensen-sitivität gegenüber 250 kVp Röntgen sowie 270 MeV/u, 100 MeV/u und 11.4 MeV/uKohlenstoffionen untersucht.

Sujets

• Biologie
• Gesundheit

Informations

• Publié par: technischen_universitat_darmstadt
• Publié le: 01 janvier 2009
• Nombre de lectures: 46
• Langue: Deutsch
• Poids de l'ouvrage: 14 Mo

Extrait

GmbHSchwerionenforschungfürHelmholtzzentrumGSITechnischeUniversitätDarmstadt

Radiobiologicalexperimentsforcarbonion

prostatecancertherapy:Interplayofnormal

andtumorcellsinco-cultureandmeasurement

ratioenhancementoxygentheof

VomFachbereichBiologiederTechnischenUniversitätDarmstadt

zur

desErlangungGradesakademischen

naturaliumrerumDoctoreines

onvDissertationgenehmigte

Dipl.-Ing.BiotechnologieClärevonNeubeck
(Main)Frankfurtaus

1.Referent:Prof.Dr.GerhardThiel
2.Referent:Prof.Dr.GerhardKraft

31.07.2009Einreichung:deragT

TagdermündlichenPrüfung:28.09.2009

2009DarmstadtD17

Zusammenfassung

Co-KulturSystemesindhäufigeingeeignetesModellumdieReaktionvonGeweben
invitrozuuntersuchen,diebeieinerStrahlentherapienotwendigerweisegleichzeitigals
Ziel-undNachbarvolumenexponiertwerden.IndieserArbeitwurdeeinCo-KulturMod-
ellaufBasisvonRattenzelleneinesProstatakarzinoms(DunningR-3327-AT-1)unddes
DünndarmepithelsentwickeltumdieBestrahlungssituationeinesProstatakarzinompa-
tientenzusimulieren.BeideZelllinienwurdeninMono-KulturenaufihreStrahlensen-
sitivitätgegenüber250kVpRöntgensowie270MeV/u,100MeV/uund11.4MeV/u
Kohlenstoffionenuntersucht.AusdenÜberlebensdatenwurdendieParameterdesLinear-
QuadratischenModells,αundβ,errechnetunddierelativebiologischeWirksamkeit
(RBW)bestimmt,wobeidieRBWαderstrahlenresistenterenProstatakarzinomzellline
imGegensatzzurDünndarmzellliniegrößerwar.DerVergleichvonRBWWertener-
rechnetmitdemlocaleffectmodel(LEM)zeigtesehrguteÜbereinstimmungenmitden
gemessenenWerten.DieDatenausMono-KulturenwurdenverglichenmitCo-Kulturen
unbestrahlterundbestrahlterZellen(250kVpRöntgen,100MeV/uund11.4MeV/u
Kohlenstoffionen)beiderZelllinien.DiegemesseneSynergieindenCo-Kulturenwurde
aufbestrahlungsabhängigeund-unabhängigeFaktorenzurückgeführt.UmdieseEffekte
zuuntersuchenwurdedieSekretionderinammatorischenZytokineTGFβ,TNFαund
IL-2gemessen.Eszeigtesich,dassderenSekretionunabhängigvonderBestrahlungund
derCo-Kulturwar.
InderTumortherapiestellenhypoxischeTumorarealeaufgrunderhöhterStrahlenresistenz
einProblemdar.UmZellenunterdefiniertenSauerstoffbedingungenzukultivierenund
zubestrahlenwurdeeineKammerentwickelt,inderderSauerstoffgehaltgezieltreg-
uliertwerdenkann.IndieserKammerwurdendieProstatakarzinomzellenunteroxischen
undhypoxischenBedingungenmitKohlenstoffionenmiteinemLETvon100keV/µm
bestrahlt.DerSauerstoffverstärkungsfaktor(OER)wurdefürRöntgenbestrahlungenmit
OER=2,35undfürKohlenstoffionenmitOER=1,5bestimmt.DieErgebnissederCo-
KulturundderExperimentemitdefiniertemSauerstoffgehaltwurdenunterdemGesicht-
diskutiert.Prostatakarzinomtherapiederspunkt

iii

Summary

Co-culturemodelsarehelpfultoexaminecelltocellinteractionsinvitroandtoassess
thecross-communicationbetweentwoparticularcellpopulations.Co-culturesystems
partiallyreectthecomplexinvivosituation:inthisstudyaninvitroco-culturemodel
ofprostatecancercells(DunningR-3327-AT-1)andsmallintestinecells(intestinalep-
itheliumcellline6)oftheratwasestablishedtosimulatethecarboniontreatmentof
prostatecancerpatientsatGSI.Bothcelllineswerecharacterizedinmono-culturesfor
theirradio-biologicalresponseagainst250kVpx-raysandcarbonionsof270MeV/u,
100MeV/u,and11.4MeV/u,respectively.Theparametersofthelinearquadraticmodel,
αandβ,forcellsurvivalcurvesweredeterminedaswellastherelativebiologicalef-
fectiveness(RBE).ThemeasuredRBEvalueswerecomparedtocalculationsofthelocal
effectmodel(LEM)andwereinagreementtothecalculations.TheRBEαvalueincreased
strongerforthemoreradio-resistantprostatecancercelllinethanfortheepitheliumcell
line.Thesurvivalofunirradiatedandirradiatedcellsfromco-cultures(250kVpx-rays;
100MeV/uand11.4MeV/ucarbonions)wascomparedtomono-culturesunderthesame
conditions.Themeasuredeffectswereattributedtoirradiationindependentaswellasto
irradiationdependentfactors.Tostudytheseeffects,theinammatorycytokinesTGFβ,
TNFα,andIL-2wereanalyzed,buttheirsecretionwasindependentofirradiation.
Tostudytheproblemofhypoxiccellsintumortreatmentahypoxiachamberwasdevel-
opedinwhichcellsweregrownunderadefinedoxygenstatus.Prostatecancercellswere
irradiatedwith250kVpx-raysandcarbonionswithaLETof100keV/µmunderoxic
andhypoxicconditions.Theoxygenenhancementratiosfor10%survivalwerefoundto
beOER=2.35forx-raysandOER=1.5forcarbonions.Theresultsoftheco-culture
modelandtheexperimentsunderdefinedoxygenstatusarediscussedinrelationtoongo-
ingprostatecancertherapy.

v

Contents

Zusammenfassung

Summary

Contents

iii

v

1oductionIntr11.1Objectives..................................1
1.2Physicalpropertiesofionizingradiationandradio-biologicalfundamentals2
1.3Theprostateanditscancers.........................6
1.3.1Dunningprostatecancercellsystem................7
1.4Theintestineandradiationsideeffects...................8
1.4.1Intestinalepitheliumcellline6...................9
1.5Cytokines..................................9

15methodsandMaterials22.1Celllinesandcultureconditions......................15
2.1.1DunningR-3327-AT-1.......................15
2.1.2Intestinalepitheliumcellline6...................15
2.1.3Co-culture.............................16
2.1.4Cryopreservation..........................19
2.1.5Growthcurves...........................20
2.1.6Clonogenicsurvivalassay.....................20
2.1.7X-Galstaining...........................21
2.2Chromosomepreparation..........................22
2.2.1Multicoloruorescenceinsituhybridization...........23
2.3Detectionofpro-inammatorycytokines..................23
2.4Flowcytometry...............................24
2.4.1Cellcycleanalysis.........................24
2.4.2FluorescencemembranelabelingwithPKH67andanalysis....25
2.5Hypoxiachamber..............................26
2.5.1Construction............................27
2.5.2Cellsamplesandhandling.....................28
2.5.3Gassingmodalities.........................29
2.6Cellirradiationprocedure..........................29

vii

Contents

3

4

viii

2.7Statisticaldataanalysis...........................31
2.7.1Errorestimationforsurvivalexperiments.............31
2.7.2CalculationofRBE.........................33
2.7.3Analysisofchromosomesamples.................34

37Results3.1CharacterizationofratadenocarcinomacelllineR-3327-AT-1......37
3.2Characterizationofintestinalepithelialcellline6.............41
3.3Survivalexperiments............................45
3.3.1RAT-1cells:radio-resistanceagainst250kVpx-rays.......45
3.3.2RAT-1cells:radio-resistanceagainstcarbonions.........46
3.3.3IEC-6cells:radio-resistanceagainst250kVpx-rays.......47
3.3.4IEC-6cells:radio-resistanceagainstcarbonions.........49
3.3.5Relativebiologicaleffectiveness(RBE)..............52
3.4Identificationofsub-populationsandclonesinIEC-6cellculture.....53
3.4.1ChromosomeanalysiswithmFISH................53
3.4.2Existenceofradio-resistantIEC-6sub-populations........54
3.4.3AnalysisofIEC-6singlecellcolonies...............57
3.5Co-culture..................................60
3.5.1Survivalexperiments........................61
3.5.2Cytokinemeasurements......................64
3.6Hypoxiachamber..............................67

71outlookandDiscussion4.1Celllines..................................71
4.1.1RAT-1Dunningprostateadenocarcinomacellline........71
4.1.2Developmentofaco-culturesystem-asuitablecelllinetoRAT-1
cellsisneeded...........................72
4.1.3TheIEC-6cellline.........................73
4.1.4IEC-6cellsub-populationsandclones...............73
4.1.5AlternativecelllinestoIEC-6cells................76
4.1.6Changingthecellsystemtohumancells..............77
4.2Mono-culturesurvivalexperiments.....................78
4.3Co-cultureexperiments...........................81
4.3.1Comparisonofmethods:cellpre-seedingversustrypsintreatment81
4.3.2Inuenceofserumonsurvivalexperimentsandcytokinedetection82
4.3.3Survivalexperiments........................82
4.3.4Cytokines..............................84

Contents

4.4Hypoxiachamber-measurementoftheoxygeneffect...........87
4.4.1OERforx-rayirradiation......................88
4.4.2OERforcarbonionirradiation...................90
4.4.3Gassingmodalities:acuteorchronichypoxia...........92
4.4.4Hypoxiachamber:outlook.....................94

yBibliograph

wledgementAckno

ErklärungEidesstattliche

Annex

solutionsUsed

esFigurofList

ablesTofList

ListofAbbreviations

vitaeCurriculum

95

111

113

I

I

III

V

VII

IX

ix

oductionIntr1

esvObjecti1.1

ThecancertreatmentwithheavyionsstartedatGSIinDecember1997.Uptotheendof
July2009,440patientswithchordomas,chondrosarcomas,andadenocysticcarcinomas
weresuccessfullytreated.Thefiveyeartumorcontrolrateincreasedfrom30-40%after
conventionaltreatmenttovalueshigherthan80%inallthesecases[123,122,21].In2006
astudyonlocallyadvancedprostatecancerwasstarted[97].Butforfuturedevelopments
intherapythenumberofindicationshastobeincreasedandthetreatmentadvantageshave
tobeextendedtoothertumortypes.Therearestillsomeunsolvedproblemsinheavyion
radiationtherapy.Onthebasisofprostatecancer,asanexample,theseunsolvedproblems
canbeexplained.Prostatecancerpatientswereirradiatedwithacombinationofinte